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medicilon

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[交流] ELISA在人工合成的连翘苷抗原免疫原性检测上的应用

连翘苷作为药用的为木犀科植物连翘的干燥果实的提取物，具有清热、解毒、散结排脓等功效。进行连翘苷的人工合成，然后进行连翘苷抗原的免疫原性检测，可为连翘苷的工业化生产提供参考依据。ELISA是当前应用最广泛的免疫检测方法，不仅可以用于免疫原性检测，还可以用于细胞因子检测。ELISA方法将抗原-抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物显色，以颜色变化判断试验结果，操作简便、无污染放射性，故应用广泛。
在机体中引起特异性免疫应答反应的物质为抗原，免疫原性指的是被注射入动物或人体内后，使其产生循环抗体或改变免疫细胞的反应性。药物的免疫原性通常是指其诱发抗药物抗体反应的能力。免疫原性的强弱是生物技术药物开发的决定因素之一，免疫原性检测可以评价药物的安全性。美迪西提供免疫原性试验服务，主要使用小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、非人灵长类动物做免疫原性毒性试验。
1、连翘苷人工抗原的合成
　　采用高碘酸钠法，将购自某公司的连翘苷（FRn）分别与牛血清白蛋白（BSA）偶联成人工免疫原，与卵清蛋白（OVA）偶联成包被原。具体方法如下：准确称取连翘苷5.0 mg充分溶于1 mL 20%甲醇中，NaIO4 8.0 mg充分溶于1 mL蒸馏水中，将二者混合，密封并用锡箔纸包裹避光，室温下搅拌反应1.5 h，得到连翘苷的氧化产物，成为A液。用0.1 mol・L-1 Na2CO3（pH 9.6）调pH至9.0以上。准确称取BSA/OVA各10.0 mg分别充分溶于1 mL 碳酸盐缓冲液（CBS）中，成为B液。然后将A液逐滴加入B液中，用0.1 mol・L-1 Na2CO3（pH 9.6）再次调pH至9.0以上，封闭并避光，室温下搅拌6 h或过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至用蒸馏水预处理的透析袋中，搅拌下用蒸馏水透析72 h，中间多次换液。透析后的产物分装，于-20 ℃保存待用。
2、连翘苷人工抗原的免疫原性检测
（1）紫外扫描法
用蒸馏水精确配制适宜浓度的FRn与BSA，OVA标准溶液，将待测样品用蒸馏水稀释到适宜浓度，用紫外分光光度计测出FRn，BSA，FRn-BSA，FRn-OVA，OVA的全波长图谱。
（2）薄层色谱法
按2010年版《中国药典》方法进行。用蒸馏水配制适宜浓度的FRn，BSA，OVA标准溶液，将待测样品FRn-BSA和FRn-OVA用蒸馏水稀释到适宜浓度。将标准溶液和待测样品分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶1）为展开剂，展开后晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液，加热到108 ℃显色。
（3）动物免疫
用FRn-BSA免疫原以背部皮下多点注射免疫的方法免疫5只雄性BALB/c小鼠。初次免疫用等量的弗式完全佐剂充分乳化，免疫剂量为100 μg/只，以后每14 d左右加强免疫1次，改用弗式不完全佐剂乳化抗原，免疫剂量不变。从第3次加强免疫开始后每7 d断尾取血，之后5 000 r・min-1，离心10 min分离血清，分别编号为1～5。
（4）ELISA法测定血清中的抗体效价
以FRn-OVA作为包被原，用CBS稀释至1∶1 000，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g・L-1明胶为封闭液，每孔加200 μL，37 ℃孵育1 h。洗板。抗血清稀释倍数为1 000，2 000，4 000，8 000，16 000，32 000，64 000，128 000倍。以未免疫空白小鼠的血清作为阴性对照，37 ℃孵育1h，洗板。每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠二抗（1∶10 000），37 ℃孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 μL，37 ℃孵育显色15 min后每孔加2 mmol・L-1硫酸50 μL终止反应，测定吸光度A450 nm。以同一稀释倍数下抗血清（P）与阴性血清（N）A450 nm比值（P/N）大于2.1时血清的最大稀释度定为抗体效价。
（5）icELISA法测定血清中的抗体特异性
以FRn-OVA作为包被原，用CBS稀释至1∶1 000，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g・L-1明胶为封闭液，每孔加200 μL，37 ℃孵育1 h。洗板。抗血清稀释倍数为2 000，FRn分别稀释为100，50，25，12.5，6.25，3，1 mg・L-1和对照值0 mg・L-1，每孔分别加入小分子和抗血清各50 μL。37 ℃孵育1 h，洗板。每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠二抗（1∶10 000），37 ℃孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 μL，37 ℃孵育显色15 min后每孔加2 mmol・L-1硫酸50 μL终止反应，测定A450 nm。
3、结果
（1）FRn-BSA，FRn-OVA的紫外光谱鉴定
通过分析FRn，FRn-BSA，BSA，FRn-OVA，OVA的紫外光谱，可以看出FRn紫外特征吸收峰为276 nm；BSA及OVA紫外特征吸收峰为278 nm，FRn-BSA及FRn-OVA紫外特征吸收峰为277 nm，另在290～330 nm处的紫外吸收明显区别于FRn和BSA及OVA，其中在310 nm处有一肩峰，因此可以判断FRn成功偶联于BSA及OVA上。
（2）FRn-BSA和FRn-OVA的薄层色谱图
　　薄层色谱是鉴定人工抗原合成的简便方法。FRn，BSA，OVA，FRn-BSA，FRn-OVA经薄层色谱，FRn的Rf约为0.5，并显示出紫棕色斑点，但BSA，OVA在此显色条件下点样原点并未出现棕色斑点，而FRn-BSA，FRn-OVA在点样原点亦显示棕色斑点。上述结果说明连翘苷偶联在BSA和OVA上。
（3）动物免疫实验结果
1）ELISA法测定血清中的抗体效价结果
经过5次免疫后小鼠血清中有抗FRn抗体产生，以P/N≥2.1为标准，抗体效价在1∶8 000。
2）icELISA法测定血清中的抗FRn抗体特异性
经检测，FRn对5只小鼠的免疫血清均有竞争抑制，表明小鼠血清中产生的抗体具有连翘苷特异性，以连翘苷浓度为0对应的孔A450 nm为A0，以其他各种浓度连翘苷对应的孔A450 nm为A，计算小鼠抗血清间接接竞争抑制曲线的线性方程和R2，以及灵敏度（抑制率为10%时连翘苷的质量浓度）。
免疫原性检测是生物技术药物临床安全性评价的重要组成部分，药物引起的抗体反应会影响药动学、药效或毒性反应。在药物临床试验阶段，进行免疫原性检测已是工人的评价指标指标之一。

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