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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR到qPCR的问题
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)

[求助] PCR到qPCR的问题 已有1人参与

土壤DNA提取完后进行了普通PCR和凝胶成像，下一步想做qPCR，请问中间还要有哪些过渡实验吗？比如PCR产物纯化，目的基因克隆，质粒提取，测序等，是必须要做的吗？能不能用提取的DNA直接做qPCR？新手求指教？

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1楼 2018-10-15 22:27:58
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lansong9783 at 2018-10-16 04:35:42
可以直接做，注意定量的扩增片断一般200bp左右，你的引物是否符合。

片段是在160到210bp之间的，应该符合要求。但是普通PCR凝胶成像显示出条带后，不是还要进行测序才能进一步确定目的基因吗？测序的话就要进行质粒提取，不还是要进行中间的那几步吗？

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4楼2018-10-16 23:06:08
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lansong9783

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
moyu墨鱼(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-10-16 10:28:35
可以直接做，注意定量的扩增片断一般200bp左右，你的引物是否符合。
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2楼2018-10-16 04:35:42
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美亿美生物

捐助贵宾 (职业作家)

技术服务-实验代做
要看想要的结果是什么，直接做，设置内参做相对定量。还是构建标曲做绝对定量。土壤DNA大多含有杂质，视提取结果看是否纯化。余下都是常规操作，一搜一大把操作路线。但首先要明白，自己想要的结果是什么

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3楼2018-10-16 09:11:00
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moyu墨鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 美亿美生物 at 2018-10-16 09:11:00
要看想要的结果是什么，直接做，设置内参做相对定量。还是构建标曲做绝对定量。土壤DNA大多含有杂质，视提取结果看是否纯化。余下都是常规操作，一搜一大把操作路线。但首先要明白，自己想要的结果是什么
...

想要得到的结果是得出目的基因的相对丰度，我看有些文章说是用相对定量，但是也提取质粒做了标准曲线。基因相对丰度是样本中目的基因的决对拷贝数/内参基因16S-rRNA绝对拷贝数，这是相对定量吗？是不是文章中写错了吗？？

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5楼2018-10-16 23:34:50
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