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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TA克隆，验证总不对
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lren_87

铁杆木虫 (正式写手)

傻子乐

[求助] TA克隆，验证总不对 已有1人参与

非常简单的实验，耽误了很久，一直都不对。

细菌16S片段，插入pMD-18t载体，连接转化完了后凃平板，挑取单菌落进行PCR验证，用的M13F和M13R的引物验证，要么PCR验证失败，要么PCR结果出现1-2条带，都非常亮，但是都大于2000bp，实际M13F和M13R间的序列+16S的序列应该是在1700bp左右。

后来直接把重组质粒提取出来，然后送测序，结果全部都不成功，测了10多次，要么套峰，要么直接信号弱。

这个问题怎么破？？？这么简单的实验，耽误了几个月了，求大佬伸出援手。
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大浪淘沙
1楼 2018-06-30 11:19:24
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lren_87

铁杆木虫 (正式写手)

傻子乐
引用回帖:
2楼: Originally posted by 呆呆戴戴 at 2018-06-30 12:27:53
引物特异性不好 pcr产物不纯 可以切胶回收目的片段大小附近的凝胶 回收后进行二次PCR

插入片段已经是纯化过了的
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大浪淘沙
3楼2018-06-30 12:35:47
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呆呆戴戴

新虫 (著名写手)
引物特异性不好 pcr产物不纯 可以切胶回收目的片段大小附近的凝胶 回收后进行二次PCR

发自小木虫IOS客户端
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2楼2018-06-30 12:27:53
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petty04

新虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+3, 鼓励交流 2018-07-02 01:37:05
换个不同抗性的载体试试；换个靠谱的cloning kit，推荐Invitrogen的 TOPO TA cloning kit；另外，感受态确定是好的？不确定的话重新制备感受态细胞。TA克隆很简单，把每一步不确定是否有问题的东西都换掉，肯定能解决。
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4楼2018-07-01 13:27:51
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