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载体构建 已有1人参与
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我的一个亚细胞定位的载体，载体原本标注的只有一个Bam HI的酶切位点，但是我用单酶切出来两条带，我不想重新修改目的基因的酶切位点了，请教大佬们，我用Age I和Bam HI双酶切，然后给载体去磷酸化，再和我的用Age I和Bam HI酶切目的基因连接，可以么？ @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫IOS客户端 |
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1、载体是别的实验室拿来的，他们也用过Bam HI，说没有问题，但我确实单用Bam HI切出了两条带。 2、Age I验证过可以切开 3、我之前试过用Age I和Bam HI双酶切，但是连接后，长得斑太多了，假阳性太多，所以我可不可以，双酶切后在去磷酸化，防止两端都是Bam HI的载体连接 发自小木虫IOS客户端 |
3楼2018-05-16 20:31:07
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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1. 不知道你原始载体是哪里来的，比如是跟人家要的还是实验室以前构建留下的，如果酶切结果与你的预期不一致，而你的预期是基于很确定的资料的话，最好（1）跟来源的人或者单位再确认一下载体的问题，看能不能更换更准确的载体；（2）送去测序，保证你的MCS区域或者你关心的那些关键区域的序列起码是正确的，同时，不知道你的质粒是否比如说经过长时间保存之类的，你可以转克隆感受态再挑斑多鉴定几个，看看能不能得到酶切鉴定正确的克隆，然后再拿来用 2. 你说用Age I和BamH I酶切并且连接，这个本身和上面BamH I单酶切鉴定不正确没有太直接的关系，只要你的Age I也能够切开质粒（不知道你用Age I验证过没有？），理论上就可以进行双酶切连接，当然，看你现在的情况可能载体上有两个BamH I的位点，那加入Age I的位点位于这两个Bam H I之间，双酶切之后Age I位于小条带你不要的那个小条带上，这样确实也不行，所以一定要用Age I验证一次 |
2楼2018-05-16 19:21:34
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把你的电泳图发给他们，当然你一定要保证你的酶切没有问题 他们如果做的没有问题，就让他们把没有问题的给你一份，这种载体骨架要是出问题，你后面的实验就像埋了定时炸弹一样 所以也建议对MCS区域测序，确定你目的片段插入的位点附近序列究竟是什么，是否正确 你连接后长斑假阳性多，这相对上面的问题来说又是另一个问题，可能跟你的连接体系、连接时间都有关系，从而造成高背景。一般双酶切不需要去磷酸化，一般对于平末端连接或者单酶切连接才需要防止自连 最重要的还是建议你把载体搞清楚，可能你觉得再要一次不太容易或者不好意思，但还是硬着头皮要个正确的吧，谁也保不准到底哪段序列出了问题，再次就是优化你的连接体系，如果想去磷酸化处理防止自连不是不可以，去磷酸化本身也需要些优化，而且增加你的操作步骤 发自小木虫Android客户端 |
4楼2018-05-17 09:25:58
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不好意思，最后一个问题没解释清楚 你要是考虑是BamH I单位点造成自连，载体肯定是可以去磷酸化处理的，一般也是这么做的，但是，你的前段是双位点，在这种假设的前提下，你片段即使连上去了，这个序列说实话也真是有问题的，即便你说可能是通过菌体自身的修复机制将片段的Age I末端和载体的BamH I末端连接了 发自小木虫Android客户端 |
5楼2018-05-17 09:31:32
