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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 用Sal1和Mlu1构建载体求助！
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bbyu007

木虫 (正式写手)

[交流] 用Sal1和Mlu1构建载体求助！

打算用高保真酶KOD先PCR扩增目的片段（作为insret），上游引物加Sal1酶切位点，下游引物加Mlu1酶切位点，然后连pEASY-T（Blunt）载体并将此目的片段切出来备用。
请问：（1）可以用这2个酶做双酶切反应吗，效果好吗？（我查到这2个酶都用 H buffer，酶切反应温度均为：37°C）
（2）载体的MCS上也有这2个酶切位点，但是距离只有12bp，可以做双酶切反应吗？如果做分步酶切的话，Sal1和Mlu1先用哪一个？（载体MCS上，这2个酶切位点的先后顺序为：Sal1 、Mlu1）

敬请高手虫虫进来解答！在线等！感激涕零啦~~
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我是笨笨鱼~~~
1楼 2009-03-21 18:41:47
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bbyu007

木虫 (正式写手)
怎么没人来啊。。。
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我是笨笨鱼~~~
2楼2009-03-23 12:38:33
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
350784478(金币+1):感谢回答
我想知道，既然在引物加了酶切位点
为何还要连上T载体再酶切呢？多此一举了
P出来回收直接就切了

用NEB的内切酶，没有所谓的好切不好切的问题，绝对能够切出来
切不出来就是自己的错……

H buffer？看起来像是Takara的命名方法~~
bless一下……做不出来不要灰心……这是正常的
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3楼2009-03-23 12:57:44
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
★
350784478(金币+1):感谢回答
Mlu1是平末端，连接效率不算高，Takara的酶，两个都是绿盖子，只要说明书上说可以，这个还有什么问的？12bp足够了，要求保护碱基最多的也多不过这个数。应该很好做，做不出来再说啊。
还有双酶切buffer，takara的说明书上有，用不着自己猜。
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For my life！
4楼2009-03-23 13:15:55
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bbyu007

木虫 (正式写手)
回复2楼：KOD高保真酶扩出来的是平端的，不能直接酶切吧。。。是takara的酶。请给经验！
回复3楼：说明书上没说。。。请指点！
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我是笨笨鱼~~~
5楼2009-03-25 21:15:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by bbyu007 at 2009/3/25, 21:15:
回复2楼：KOD高保真酶扩出来的是平端的，不能直接酶切吧。。。是takara的酶。请给经验！
回复3楼：说明书上没说。。。请指点！

干嘛不能酶切？引物不是加了酶切位点和保护碱基了吗？平端A端有什么所谓？好好温习分子克隆的原理
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6楼2009-03-25 21:32:26
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
引用回帖:
Originally posted by bbyu007 at 2009-3-25 21:15:
回复2楼：KOD高保真酶扩出来的是平端的，不能直接酶切吧。。。是takara的酶。请给经验！
回复3楼：说明书上没说。。。请指点！

你看得是酶的说明书吧，看takara的说明书！！！
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For my life！
7楼2009-03-25 21:46:30
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