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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 求助 双酶切连接

我们最近做双腿酶切连接,用Nco1和Hind3酶切载体和pcr产物3小时,然后用全式金T4连接酶25度连接15分钟。这里我做了两个,一个只加了酶切载体没加片段,另一个正常加,两者其它条件都一样。转化后涂板,12小时后,只加载体的长了很多 ,而正常加的几乎没长。请问这会是什么原因啊?谢谢大家啊。
双酶切条件应该没问题,前几天我切过,效果很好。
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

酶切后先跑胶看了一下,没有非特异性条带,所以直接过柱子纯化的。载体也是这样纯化的。
3楼2009-03-15 16:39:54
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客

酶切以后片断怎么回收的?
还有,回收不干净的话,导致载体自连夜很正常的。
关于连接产物没有转化的原因很多,你给的信息太不足了,不能判断。
For my life!
2楼2009-03-15 16:33:55
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

换用NEB的内切酶和连接酶保证能够做出来,而且不用切三个小时那么久,按照酶活定义调整时间
4楼2009-03-15 18:42:07
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tt1232028

铁虫 (小有名气)

谢谢大家了  我再试一下吧
5楼2009-03-16 13:38:47
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