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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » DNA回收浓度低的问题求助
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keyanhrc

新虫 (小有名气)

[求助] DNA回收浓度低的问题求助

要构建质粒，对PCR产物 和 载体单酶切后 用天根通用型DNA回收试剂盒回收的，PCR产物1kb左右，载体5kb左右。  PCR产物回收浓度挺好的，240多ng/微升。但是 载体回收浓度就很低了，才20ng/微升。30微升的回收体积。不知问题出在哪里呀？ 因为下一步还要再做一次单酶切，所以第一步酶切想要浓度高一点。请大侠指教！
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1楼2017-12-14 21:28:26
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rhjilio

新虫 (小有名气)
你这是分步酶切么？

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2楼2017-12-14 21:41:57
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keyanhrc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by rhjilio at 2017-12-14 21:41:57
你这是分步酶切么？

是的，分两步单酶切。     50微升酶切体系，添加 2微克的DNA，5个管合一个柱子，30微升回收。
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3楼2017-12-14 21:44:46
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rhjilio

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-12-15 09:25:10
有两种方法！第一，逼迫质粒增加拷贝数，第二，用前一次甚至前几次洗脱液洗脱新的吸附柱！

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keyanhrc
4楼2017-12-14 21:45:33
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keyanhrc

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by rhjilio at 2017-12-14 21:45:33
有两种方法！第一，逼迫质粒增加拷贝数，第二，用前一次甚至前几次洗脱液洗脱新的吸附柱！

哇，“用前一次甚至前几次洗脱液洗脱新的吸附柱”这个方法虽然不是我想要的，但很有创意！为你点赞！
      但我总想弄明白，为什么 总量相同的情况下，PCR产物和载体的回收浓度会差别这么大呢？
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5楼2017-12-14 21:52:43
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fenggeshj

新虫 (小有名气)
你的PCR产物是经过扩增后的，你的载体有进行扩增吗？载体本身就比产物少，怎么会回收一样的量呢？
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6楼2017-12-28 15:19:27
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Korea??

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by keyanhrc at 2017-12-14 21:44:46
是的，分两步单酶切。     50微升酶切体系，添加 2微克的DNA，5个管合一个柱子，30微升回收。...

对哦，我单管P出来的相同的目的基因每管量都少的可怜，可以合柱的哦，我怎么没想到呢？

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7楼2018-01-16 22:02:53
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