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籣103103

铜虫 (小有名气)

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[交流] PCR常见问题及对策，据说会了撩妹不是事~ 已有3人参与

无扩增条带
（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。

（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

2
PCR产物量过少
（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3） PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4）引物量不足。增加体系中引物含量。
（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7） DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

3
扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。

（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大； ②凝胶没有凝固好； ③琼脂糖质量差。

（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

4
扩增产物出现多条带（杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。

5
阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

6
条带大小与理论不符

1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

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