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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目的基因条带太浅怎么回收测序啊啊啊···
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)

[交流] 目的基因条带太浅怎么回收测序啊啊啊···

万能的小木虫大神们：
       请教一下我想用目的基因测序，但是所用菌株里目的基因的序列在NCBI上查不到，我就用了文献里的相关引物进行扩增。做了梯度PCR在基因组里扩出来了，但是条带很浅，无法进行后续的纯化或胶回收，肿么办啊？该从哪方面入手PCR还是合成引物？跪求大神们支招···
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1楼 2017-09-17 14:05:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

游在水里的鱼

银虫 (小有名气)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
可以不回收，直接用这个当模版，在p一次

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2楼2017-09-17 14:12:29
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非洲木棉

新虫 (初入文坛)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
直接连接t载体，琼脂糖电泳与空载比对筛选后送测
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19楼2017-09-18 13:36:23
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普通回帖

zuiaixuexi

至尊木虫 (文坛精英)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
祝好运
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3楼2017-09-17 14:23:08
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守望者047

金虫 (小有名气)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
直接以产物原液为模板再跑一次PCR

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4楼2017-09-17 15:47:02
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domopal

铁杆木虫 (正式写手)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
记得稀释

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7楼2017-09-17 19:17:40
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 游在水里的鱼 at 2017-09-17 14:12:29
可以不回收，直接用这个当模版，在p一次

我试了，之前做的梯度，在有条带的几个温度里选了一个较好的，取PCR产物1ul为模板又P了一次，结果跑胶出来啥都没有了
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8楼2017-09-17 20:05:28
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 守望者047 at 2017-09-17 15:47:02
直接以产物原液为模板再跑一次PCR

恩恩，取了1ul的产物为模板又做了一次，然而这次出来连之前淡淡的条带也没有了，是我哪里出错了吗
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9楼2017-09-17 20:07:43
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by domopal at 2017-09-17 19:17:40
记得稀释

是什么要稀释啊？
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10楼2017-09-17 20:07:58
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sony8620

铁杆木虫 (文学泰斗)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
祝好

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15楼2017-09-17 21:06:50
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黑胡椒牛排

新虫 (初入文坛)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
扩完直接先连个通用载体，筛出来再测

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16楼2017-09-17 21:57:40
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 黑胡椒牛排 at 2017-09-17 21:57:40
扩完直接先连个通用载体，筛出来再测

里面引物二聚体很亮，还有杂带，不需要纯化或胶回收了吗？
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17楼2017-09-18 08:56:25
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黑胡椒牛排

新虫 (初入文坛)
菌检筛一下正确大小就好了

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18楼2017-09-18 11:25:28
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 非洲木棉 at 2017-09-18 13:36:23
直接连接t载体，琼脂糖电泳与空载比对筛选后送测

连T载前不是要纯化吗，之前有个很浅的条带纯化完跑胶看没有了
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20楼2017-09-21 08:55:01
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 非洲木棉 at 2017-09-18 13:36:23
直接连接t载体，琼脂糖电泳与空载比对筛选后送测

连T载前不是得对PCR产物纯化吗，之前有个很暗的条带纯化完完全没有了
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21楼2017-09-21 08:56:37
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 黑胡椒牛排 at 2017-09-18 11:25:28
菌检筛一下正确大小就好了

不用连t载直接纯化吗？
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22楼2017-09-21 08:58:01
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静静的泪滴

铜虫 (初入文坛)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
1. 关于上面直接取1μl当模板做PCR是不可以的，需要稀释，用纯水稀释就可以，至少稀释30倍以上。不然至少会出现许多非特异性条带。
2. 实在没办法，链接T载体也算是个办法，有时候回收跑胶看不见带，不代表完全没有，可以连一下试试，虽然失败的可能性很大。
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23楼2017-09-28 14:59:00
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不语春秋

禁虫 (小有名气)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
nono2009: 屏蔽内容, 违规存档 2017-10-23 06:28:54
本帖内容被屏蔽
24楼2017-10-20 14:54:34
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cxh90

新虫 (著名写手)
★
婷宝宝2013(金币+1): 谢谢参与
再p一次

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25楼2018-10-08 18:46:41
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wdxmu5楼
2017-09-17 16:50   回复  
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gengxin606楼
2017-09-17 18:22   回复  
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zhaoyan197811楼
2017-09-17 20:20   回复  
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slytjiaofei12楼
2017-09-17 20:31   回复  
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syhorchid13楼
2017-09-17 20:41   回复  
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dongmings14楼
2017-09-17 20:46   回复  
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