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Ivy_Yau

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR反应条件的改进,求大牛 已有4人参与

如题,我在做两个种属的目的片段扩增,分别是大鼠和人的。
目的片段在最上面第一条marker的附近,大概2kb的大小
反应程序如下:
98度 10min
98度 30s
58or62度 30s
68度 1kb/min
30-35cycle
68度 10min

PCR用的是Takara的primerstar高保真酶

图一退火温度是62度,引物Tm69度左右
图二退火温度是58度,引物Tm64度左右
引物Tm值都是算上酶切位点的

觉得目的条带太暗了,特别是图片上左边的条带,胶回收后浓度只有20多ng/ul,有什么条件可以改进的吗?求建议!谢谢大家!

PCR反应条件的改进,求大牛


PCR反应条件的改进,求大牛-1

用的是cDNA做模板进行PCR扩增
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最-难忘

木虫 (正式写手)

2楼2017-09-11 00:24:28
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domopal

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
Tm值不能算上酶切位点

发自小木虫Android客户端
3楼2017-09-11 08:42:03
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yuanyuanlg01

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
要进行尝试譬如做小量的温度梯度,看你的GC比例高的话加DMSO,或者切角回收做模版再次PCR等等。
4楼2017-09-11 11:07:44
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781055707

木虫 (著名写手)

3楼正解。
采菊东篱下,悠然见南山。
5楼2017-09-11 11:29:12
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