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临溪蜚蜚

新虫 (初入文坛)

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[求助] 菌液PCRp不出来？！！！已有9人参与

最近在做构建质粒的实验。我是以cDNA为模板p全长为1kb的基因，用连接产物转化DH5a，板上长的单克隆并不多，且菌落比较小，挑单克隆摇菌后进行菌液PCR，之后鉴定没有出现条带，阳性对照也没有条带，请问这种情况会是什么原因呢？载体已经去磷了，引物也没有错。希望知道的朋友能给解答一下，感激不尽！
PCR体系如下：
                                    10ul
               菌液             2
            10Xbuffer       1
               taq             0.2
               dNTPs          0.75
               F                   0.25
               R                0.25
               ddH2O       5.55

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1楼 2017-08-21 20:38:19

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

临溪蜚蜚

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引用回帖:

6楼: Originally posted by ghst110 at 2017-08-22 11:05:12
不知道楼主是什么抗性的质粒。如果感觉单菌落生长不正常，可能就不是你想要的转化子；
菌液PCR是比较好P出来的。但是10ul体系加2ul菌液实在太多了（原则上任何模板体积不应超过反应体系1/10），因为Reaction Buffe ...

好的，谢谢我用的是卡那的抗性板，载体已经去磷了，我觉得自连的可能性很小，如果板上长的不是空载和重组质粒，那该是什么呢？