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吴秋兰

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by elmanbio at 2017-08-16 16:55:34
不知道你为什么用试剂盒!这个tail-pcr看看文献就可以了,刘耀光老师(没有记错的话),只要你pcr引物设计的没有问题,理论上就可以,当年我也是第一次做,引物多下功夫就可以了!...

好的,谢谢

发自小木虫Android客户端
11楼2017-08-18 23:34:24
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吴秋兰

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by elmanbio at 2017-08-16 16:55:34
不知道你为什么用试剂盒!这个tail-pcr看看文献就可以了,刘耀光老师(没有记错的话),只要你pcr引物设计的没有问题,理论上就可以,当年我也是第一次做,引物多下功夫就可以了!...

如果目的片段的GC含量特别高,导致引物设计的不符合要求怎么办呢,我第一轮的引物和第二轮的引物离的比较远大概有200bp的距离了才能设计出比较符合条件的引物,可是试剂说明书是说最最好距离60~100bp

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12楼2017-08-18 23:38:28
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elmanbio

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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12楼: Originally posted by 吴秋兰 at 2017-08-18 23:38:28
如果目的片段的GC含量特别高,导致引物设计的不符合要求怎么办呢,我第一轮的引物和第二轮的引物离的比较远大概有200bp的距离了才能设计出比较符合条件的引物,可是试剂说明书是说最最好距离60~100bp
...

一般来说要100bp比较合适,这样你琼脂糖检测的时候容易区分第一轮和第二轮的大小区别,另外,引物设计原则那是理想化的引物,而实际情况你经常会遇到不能按照引物设计原则来设计的模板,那就瘸子里面挑将军,退而求其次,特别是你pcr 某些基因的CDS序列,那就别无选择,直接2头各取25bp左右,尽可能的让引物理想化!
13楼2017-08-21 09:01:53
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elmanbio

金虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 吴秋兰 at 2017-08-18 23:38:28
如果目的片段的GC含量特别高,导致引物设计的不符合要求怎么办呢,我第一轮的引物和第二轮的引物离的比较远大概有200bp的距离了才能设计出比较符合条件的引物,可是试剂说明书是说最最好距离60~100bp
...

一般来说要100bp比较合适,这样你琼脂糖检测的时候容易区分第一轮和第二轮的大小区别,另外,引物设计原则那是理想化的引物,而实际情况你经常会遇到不能按照引物设计原则来设计的模板,那就瘸子里面挑将军,退而求其次,特别是你pcr 某些基因的CDS序列,那就别无选择,直接2头各取25bp左右,尽可能的让引物理想化!
14楼2017-08-21 09:02:10
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吴秋兰

新虫 (小有名气)

15楼2017-08-26 22:36:06
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婷宝宝2013

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
hello楼主,我最近也在用Takara的试剂盒扩未知序列,但怎么也扩不出来。扩出来的不同片段DNA去测序与已经序列的末端比对,都比对不上。只有设计的引物那20多个bp一样,前面距离位置序列100多个bp完全不匹配,想请教请教你~
16楼2018-05-03 14:35:59
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