24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 4373  |  回复: 19

dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求各位前辈帮忙分析一下:PCR产物电泳,出现弥散状和双条带是什么原因已有1人参与

样品1,2,3都是PCR产物。为什么样品1出现弥散状条带,样品3出现双条带

求各位前辈帮忙分析一下:PCR产物电泳,出现弥散状和双条带是什么原因
2017.8.8   marker问题照片.png
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jie_1994

新虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-11 07:46:27
弥撒可能是样品模板两多了或者循环数多了,有时候酶量过多也会导致调带弥撒;双带可能是引物的非特异性扩增

发自小木虫Android客户端
2楼2017-08-09 11:05:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dpsdxa212: 金币+20, ★★★很有帮助 2017-08-10 23:10:25
如果有目的条带,退火问题在一定范围内都会有目的条带出现,退火温度不同无非就是杂带亮点或弱点,我觉得可能是引物或模板有问题,引物的问题可能性比较大。。。。
4楼2017-08-09 13:38:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jie_1994

新虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-11 07:46:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by dpsdxa212 at 2017-08-09 11:26:21
多谢多谢,弥散的问题我回去试试。那个双带的问题,请问应该如何解决呢。3个月前,我用这个引物扩PCR是单条带。于是我重新合成的相同的引物去扩,却出现双带。出现双带的引物Tm值 分别为52和51,我尝试了退火温度4 ...

其实你的退火温度比较低,可以尝试提高退火温度看看能不能减少非特异性扩展,平时我们扩展退火温度一般设置为60°左右的

发自小木虫Android客户端
6楼2017-08-10 15:39:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jie_1994 at 2017-08-09 11:05:42
弥撒可能是样品模板两多了或者循环数多了,有时候酶量过多也会导致调带弥撒;双带可能是引物的非特异性扩增

多谢多谢,弥散的问题我回去试试。那个双带的问题,请问应该如何解决呢。3个月前,我用这个引物扩PCR是单条带。于是我重新合成的相同的引物去扩,却出现双带。出现双带的引物Tm值 分别为52和51,我尝试了退火温度43,46,51,53,55,58,循环次数为33。全部都有双条带。
3楼2017-08-09 11:26:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jie_1994

新虫 (初入文坛)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-08-11 07:46:38
你可以先在blast上看看你的引物是否容易发生特异性克隆,如果是建议重新更换引物,如果不是,有可能是模板不纯,需要重新制备模板,或者你的引物保存不当导致引物降解了,这样的情况还是重新合成引物吧

发自小木虫Android客户端
5楼2017-08-10 14:34:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eric-amy

金虫 (小有名气)

提高退火温度试试,引物设计的不大合适

发自小木虫Android客户端
7楼2017-08-10 16:36:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by eric-amy at 2017-08-10 16:36:41
提高退火温度试试,引物设计的不大合适

恩恩,目前已重新设计引物
8楼2017-08-10 23:03:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by jie_1994 at 2017-08-10 15:39:42
其实你的退火温度比较低,可以尝试提高退火温度看看能不能减少非特异性扩展,平时我们扩展退火温度一般设置为60°左右的
...

我有一个疑惑,就是  如果退火温度大于Tm值(比如高个5度),会导致没有任何条带吗?一般来说,PCR设定的退火温度应该要比Tm值低5度左右吧
9楼2017-08-10 23:08:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dpsdxa212

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2017-08-09 13:38:56
如果有目的条带,退火问题在一定范围内都会有目的条带出现,退火温度不同无非就是杂带亮点或弱点,我觉得可能是引物或模板有问题,引物的问题可能性比较大。。。。

多谢指点。的确,我调整了梯度退火温度,确实都是类似结果,原本没有条带的,无论怎么调都一样。现在已经重新设计引物
10楼2017-08-10 23:12:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 dpsdxa212 的主题更新
信息提示
请填处理意见