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Nec99新虫 (小有名气)
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[交流]
P成这样 是不是得重新设计引物？
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用PCR引物做模版二次P，有一个亮的引物，其他的都拖尾 是因为引物不行得重新设计吗？已经试过退火温度调为60、58 还是不行 循环数也用40和35P过。延伸时间1分半 各位大神怎么办？ 发自小木虫IOS客户端 |
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2楼2017-08-07 10:20:49
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Nec99(晋鹏代发): 金币+2, 鼓励回帖交流~ 2017-08-15 23:26:50
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Nec99(晋鹏代发): 金币+2, 鼓励回帖交流~ 2017-08-15 23:26:50
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1：样品浓度过高。这种情况稀释一下就行了。提质粒的时候常出现这种情况。 2：蛋白杂质阻碍DNA的泳动。提基因组DNA时常出现这种情况。 以上两种情况，拖尾都是在电泳条带的后面。 3：样品破碎或是被降解 4：存在RNA 这两种情况，拖尾都是在电泳条带的前面。 PCR产物电泳拖尾，主要从以下两个方面考虑： 1、PCR产物自身原因：往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。 对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。 2、电泳体系的问题： （1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。 （2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。 （3）电压太高。 （4）适当把你的胶的浓度加大。（根据你的片断大小而定） （5）观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照。 |
3楼2017-08-15 20:01:32