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胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

[求助] 在构建RNA干扰载体中,目的片段与PLKO.1的连接问题 已有1人参与

新人求教
1、在合成我的干扰片段后(上海生工合成),发现目的片段的5`端是没有磷酸化的,而是羟基。因为在DNA连接时要形成3`-5`磷酸二酯键,这样目的片段和我的载体不是没有办法连接了?看了所有教程,都没有谈到5`端需要磷酸化,是不是默认合成的5端都没有磷酸化?

2、关于1的问题,我想到在单酶切载体,为了防止自身环化而用碱性磷酸酶把载体的5`端磷酸集团转为羟基,那目的片段再连接的时候是怎么连上的?
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胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-28 12:38:59
这就尴尬了……你可以通过测序看一下序列有没有插入吧,有时候酶切会出现一些理解不了的情况……
祝顺利!...

我中午联系了测序公司,待会有人来取样本。今早雅思没考过,,希望实验结果是好的。
9楼2017-07-28 16:14:49
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗?
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
2楼2017-07-27 14:18:14
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胜哥的歌

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2017-07-27 14:18:14
连接之前不是需要用T4PNK处理一下的吗?

我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化,确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。
3楼2017-07-28 09:25:41
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

引用回帖:
3楼: Originally posted by 胜哥的歌 at 2017-07-28 09:25:41
我用了同学给的TAKARA的T4PNK磷酸化,确实连上了。但是连上的经过酶切似乎不对。...

这个只能通过测序,连接上的片段很小,跑胶看不出来。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
4楼2017-07-28 10:20:00
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