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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 大肠杆菌red同源重组
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love西瓜酱

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌red同源重组 已有1人参与

大肠杆菌基因敲除，用pKD 13做PCR敲除框片段，需要DpnI 消化模版吗？还是直接胶回收目的片段就可以了？

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1楼 2017-07-22 20:59:01
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莫落

木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-23 09:27:20
肯定需要消化啊，不然都是假阳性。质粒的转化效率把重组活下来的要大的多

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2楼2017-07-22 21:54:43
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love西瓜酱

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 莫落 at 2017-07-22 21:54:43
肯定需要消化啊，不然都是假阳性。质粒的转化效率把重组活下来的要大的多

可是PKD13有3434bp,而我的敲除框片段只有1300bp,胶回收为什么不能去除模版质粒呢？

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3楼2017-07-23 16:00:34
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莫落

木虫 (正式写手)
不能完全去除，质粒会有很多形态，超螺旋跑的就比较快，很难完全去除。

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love西瓜酱
4楼2017-07-23 16:10:29
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love西瓜酱

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 莫落 at 2017-07-23 16:10:29
不能完全去除，质粒会有很多形态，超螺旋跑的就比较快，很难完全去除。

好的，谢谢你。

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5楼2017-07-23 16:49:03
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安静de执着14

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

其实不用DpnI笑话质粒模板，但要保证在PCR的时候，模板浓度不能太大，否则会造成假阳性率太高。
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6楼2017-07-28 10:59:39
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江天一览3215

新虫 (初入文坛)
做敲除的时候，如何把片段导入感受态细胞中，如果不发生同源重组，这个片段还会存在于感受细胞中吗？或者说能否pcr出我的那个片段？

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7楼2017-09-03 11:17:44
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wlxp6

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 江天一览3215 at 2017-09-03 11:17:44
做敲除的时候，如何把片段导入感受态细胞中，如果不发生同源重组，这个片段还会存在于感受细胞中吗？或者说能否pcr出我的那个片段？

我也想知道

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8楼2017-09-28 10:29:08
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小白147258

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 莫落 at 2017-07-22 21:54:43
肯定需要消化啊，不然都是假阳性。质粒的转化效率把重组活下来的要大的多

请问，我用的是PKD3将目的片段替换掉了，涂板时，也需要消化吗？因为我涂板的菌假阳性也好高

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9楼2017-10-19 13:32:15
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