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墨秦墨秦

银虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[求助] 启动子功能分析求助

求各位虫友帮忙！

本人研二，在做的课题是关于某鱼类某基因的启动子功能分析。目前在NCBI已有该物种两个版本的基因组信息，两个基因组关于该基因的序列几乎一致，自己也重新验证了该基因及其上游约2k区域的正确性，三者都几乎完全一致，只是存在若干碱基增减以及疑似SNP位点的存在。同时，在ncbi上基因组信息也提供了该基因的转录信息。我利用已经公布的转录信息，就对第一外显子之前的区域进行核心启动子预测。发现靠近mRNA第一外显子的的区域内（约1kbp）没有经典的TATAbox结构，且根据预测软件给出的结果显示，预测的核心启动子区域中的转录起始位点并未与mRNA的第一个碱基重合。现在我很担心，ncbi上公布的转录信息是否正确或者核心启动子预测是否正确。

利用cDNA及特异性引物对该基因进行pcr验证，电泳检测发现并没有条带产生（其正向引物与mRNA第一外显子的前24个碱基序列一致，反向引物为第二外显子中编码区序列），而自己设计的β-actin引物却可以跑出正常的条带。
我怕给出的转录信息有误，于是对第一外显子之后的500bp也进行启动子预测，发现在第一外显子之内（约+60）存在一个核心启动子区域，且在该核心启动子转录起始位点的上游约30bp处存在TATAbox的结构，所以我怀疑NCBI已公布的基因组信息中提供的mRNA信息有误？

随后我对上述重新预测的含有TATAbox的核心子区域，利用特异性引物及cDNA进行pcr验证，电泳结果还是没有明显的条带。
现在我很担心，究竟是NCBI公布的转录信息有误还是核心启动子预测存在问题还是或者两者皆有？此外我的CDNA是否可能存在问题导致上述情况发生。
求大家帮忙，只有这50个币