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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 构建crispr/cas9系统时载体总是自连
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Cleargo

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建crispr/cas9系统时载体总是自连

各位老师好。我在构建crispr/cas9系统时，按照张峰博士给出的protocol一步步做，用的是px458质粒，酶切后跑胶显示切开，胶回收正常。然后做序列的退火和磷酸化。之后的连接与原protocol稍有不同，采用T4连接酶16度过夜，之后转化挑菌摇菌测序。测序结果全部是载体自连。后来也试过将载体量减半，依旧没有改观，试过好多遍了还是这样。求助各位老师，如何才能解决载体自连的问题。

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1楼 2017-06-07 15:37:53
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ChengYunW


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2楼2017-06-07 15:42:46
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星梦奇缘1990

金虫 (正式写手)
protocol 上建议先载体酶切后要去磷酸吧？

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somethingattemptedsomethingreceived
3楼2017-06-07 16:03:56
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balalalabala

新虫 (小有名气)
要保证完全双酶切，或者去磷酸化把
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4楼2017-06-07 17:20:33
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Cleargo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 星梦奇缘1990 at 2017-06-07 16:03:56
protocol 上建议先载体酶切后要去磷酸吧？

按照protocol上要求的，加入了fastap，做了去磷酸化

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5楼2017-06-08 11:27:08
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Cleargo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by balalalabala at 2017-06-07 17:20:33
要保证完全双酶切，或者去磷酸化把

按照protocol上要求的，加入了fastap，做了去磷酸化

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6楼2017-06-08 11:27:17
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西瓜专业课

新虫 (初入文坛)
我也是 双酶切 老是自连 质粒用的是pWHU2653 14000bp
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7楼2017-10-23 14:53:51
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