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微梁

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌落pcr鉴定有目的条带，但不亮，而且引物二聚体很亮 已有2人参与

载体用的pet32a用NdeI和XhoI双切，引进一个带BamHI的酶切位点的片段
PCR:模板 2ul
F  1ul
R  1ul
dNTPmix   1.6ul
10xBuffer  2ul
酶   1ul
水   12ul 不知道哪里出问题了

菌落pcr鉴定有目的条带，但不亮，而且引物二聚体很亮


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1楼 2017-06-05 08:22:20
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液PCR 有目的条带，虽然不亮 但是也能证明是阳性。
然后引物二聚体很亮，我觉得可能是你的退火温度太高了，引物结合模板的很少。
建议降低退火温度。（其实我这么久都没用过64的退火温度....一般都用的55 56）
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
4楼2017-06-06 11:27:54
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紫风舞鸢

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板的量太少，或者循环数太低，适当提高退火温度，引物各取0.5ul试一试。
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云中漫步
2楼2017-06-05 13:41:54
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微梁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 紫风舞鸢 at 2017-06-05 13:41:54
模板的量太少，或者循环数太低，适当提高退火温度，引物各取0.5ul试一试。

这是我的体系，引物浓度试过0.5ul 还是阴性，而且引物二聚体仍然很亮
菌落pcr鉴定有目的条带，但不亮，而且引物二聚体很亮-1



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3楼2017-06-05 15:29:46
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微梁

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 伤何处 at 2017-06-06 11:27:54
菌液PCR 有目的条带，虽然不亮 但是也能证明是阳性。
然后引物二聚体很亮，我觉得可能是你的退火温度太高了，引物结合模板的很少。
建议降低退火温度。（其实我这么久都没用过64的退火温度....一般都用的55 56）

谢谢，相同条件，又重做了一次，就出结果了，搞不懂，也不知道哪里出问题了

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5楼2017-06-09 08:00:08
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