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桃仁兔丁

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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帖子: 5
在线: 1.2小时
虫号: 6436496
注册: 2017-05-03
专业: 生物化学

[求助] miRNA荧光定量pcr，跪求大神指点！已有1人参与

研究内容是实验组感染病毒后，realtime检测细胞中miRNA表达有无变化。
已经卡了三个月了，毫无进展，十分绝望。
1.最开始用人的原代T细胞和其他两种T细胞系来做，u6为内参，引物均为广州锐博生物订购的茎环引物。然而实验结果有一个很严重的问题就是u6的ct值极不稳定，甚至倾向于随病毒感染上调的趋势，无法定量其他miRNA的表达。
但找了大量文献，并且组内讨论认为"实验因素引起u6变化"的可能性微乎其微。
2.随后继续在T细胞系里验证，同时将GAPDH也作为内参，结果显示gapdh在细胞间稳定，而u6继续不稳定。
3.以上结果均在abi 7500测得，所有miRNA和u6从逆转录一步就使用特异茎环引物，逆转录的RNA模板均为2ug；罗氏Mix；u6 cDNA稀释100倍，其余cDNA稀释5倍。
4.这个月换了贴壁细胞来做，之前做过预实验结果和T细胞中一致，实验组u6的ct值都会变小；然而适逢7500热盖坏了，就去借用公用的abi stepone plus来跑realtime.可是现在的问题是换了仪器完全做不出来了？实验程序、体系都没变…前两次跑完全没有扩增曲线，跑胶也确实无扩增，今天事先做了普通pcr检测有产物才拿去做realtime,我调了调基线阈值，好歹有一些孔有数值了，但是数值非常随机毫无规律…比如我做了4个复孔，ct能达到19和38的差异…完全绝望…这到底是我的问题还是stepone和7500哪里不同…
每天都重振旗鼓调整实验找问题，但是每天都毫无结果…金币不多跪求师兄师姐们指点…
附今日的扩增曲线图…

@biostar2009 发自小木虫Android客户端

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