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铜虫 (正式写手)

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[求助] 关于绝对荧光定量PCR的相关问题，求教已有2人参与

本人接触分子生物不太久，最近一直在做绝对荧光定量PCR，主要做的是AOA,AOB，AOA扩增片段有635bp，AOB是491bp，都是比较长的片段，所以在做的过程中，扩增效率抑制都上不去，用的是TAKARA,的SYBRGREEN酶，尝试增加了预变性的时间，降低了退火的温度，延长了退火的时间，延长了延伸的时间，两步法变成三步法，提高引物浓度，等等等等，全部都尝试过了，至于引物，我用的是所有的文献中都提到过的很成熟的引物，引物应该是没有什么问题，我自己也不会设计，担心自己设计的也没人承认，尝试了很多条件，甚至换了仪器，体积20微升和10微升都尝试过了，调来调去的做了十几二十遍了都，但是扩增效率仍然不高，一直都在75%左右徘徊，标准质粒测过浓度和纯度，测过序列跑过PCR都没问题，稀释也没问题，R2至少是0.99以上，也没有引物二聚体。但是看文章中好多人写着扩增效率为90-110%，但是在一篇SBB文章上看到扩增效率也只有70%-80%的样子，我现在的问题是：
1.经常做QPCR或者做过AOAAOB的同学能不能给点建议指出问题所在和改进方法，感觉做AOAAOB的人特别多的，谢谢
2.如果扩增效率为75%左右，那么计算出来的拷贝数数值还能使用吗？
3.AOA的融解曲线的峰值通常在83.7℃左右，但是有的时候出峰在85℃，偏离还有点大，如果是这样的话那么85℃出峰的还是AOA的扩增产物吗？
4.通常说DNA的浓度在A260/280在1.8-2.0之间比较纯，请问如果这个值超过了2.0是说明有RNA的污染吗？
新手上路，问题有点多，非常感谢