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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于基因克隆
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FionaD

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于基因克隆 已有1人参与

在配制氨苄LB固体和液体培养基的时候，氨苄加的太少了，这对连接转化后涂平板和挑菌摇菌有影响么？还有在做回收最后一步时，离心后总是得不到足够剂量的回收产物是为什么？(比如加了15μl的Elution,离心后只有5μl左右)

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1楼 2017-05-08 13:08:58
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预估预估

新虫 (正式写手)
影响不大，但建议一般多加。氨卞青霉素主要是抑制细菌生长。

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我就是我，我就是人间不一样的烟火。
2楼2017-05-08 13:29:59
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FionaD

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 预估预估 at 2017-05-08 13:29:59
影响不大，但建议一般多加。氨卞青霉素主要是抑制细菌生长。

可是现在用的氨卞加少了的固体和液体培养基，要不就是长出来的板密密麻麻白白的长成一片，要不就是正常长了但是摇菌摇不出来是什么原因呢？

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3楼2017-05-08 16:39:34
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小薇家智慧树

铜虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-08 21:10:01
回收指用试剂盒进行gel回收或者clean up?过柱子得到一点点产物?    那应该是你离心不充分，加大转速或者时间

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凡有所学，皆有所成；得之勿喜，失之勿忧；越幸运，越努力。
4楼2017-05-08 17:23:20
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小薇家智慧树

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by FionaD at 2017-05-08 16:39:34
可是现在用的氨卞加少了的固体和液体培养基，要不就是长出来的板密密麻麻白白的长成一片，要不就是正常长了但是摇菌摇不出来是什么原因呢？
...

一般得不到阳性克隆主要问题在连接转化上，连接产物有没有验证过?

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凡有所学，皆有所成；得之勿喜，失之勿忧；越幸运，越努力。
5楼2017-05-08 17:26:35
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hx814102

新虫 (正式写手)
抗生素加少了，有影响，容易长杂菌！elusion肯定会有所损失、建议离心完一次、再重复加到吸附柱上、重复洗脱一次、可以增加洗脱浓度！

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Everydayisanewday!
6楼2017-05-08 22:38:40
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bestzdz

金虫 (小有名气)
抗生素加少了，可以在涂板的时候在平板上再涂一层
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学海无涯，乐在其中；谨言慎行，惜时自勉！
7楼2017-05-09 09:10:57
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justwantwhy

新虫 (初入文坛)
AMP加少了，对连接产物转化长菌没影响，不过就是可能有杂菌，不好挑到目的菌

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8楼2017-05-09 10:31:11
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justwantwhy

新虫 (初入文坛)
胶回收后不是长时间保存，而是直接连接的话，最后一步还是用灭菌超纯水回收好些，没什么离子，自我感觉不会影响连接反应体系

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9楼2017-05-09 10:33:49
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Mix-T

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
抗生素浓度低，筛选效率会降低，容易出现假阳性。离心后收回量少可能在加样时未加在膜中央？可能残留在收集柱上。
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10楼2017-05-09 15:18:08
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