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新虫 (初入文坛)

[求助] 来个大神帮我分析一下，PCR一直没有条带

一开始做没有条带，然后就把酶，水都换了，然后还是没有条带，怀疑是引物那里出了问题，用的是十碱基的随机引物，其实GC七个，AT三个，老师设的退火温度35度，45秒，然后我用软件分析的Tm值才23-24左右，有可能会这么低吗？愁死了，不知道那里出的问题～

1楼 2017-05-02 22:55:58

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金虫 (正式写手)

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-03 07:41:25

那么低的退火温度，话说都是顺机引物了，怎么算出来的退火温度啊。另外退火温度太低了你的引物10个碱基里有7个GC估计都成引物二聚体了吧。提高退货温度到60度看看吧

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2楼2017-05-02 23:15:32

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新虫 (初入文坛)

同意楼上。真不行设个退火温度梯度

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3楼2017-05-03 02:25:02

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新虫 (初入文坛)

引用回帖:

2楼: Originally posted by 碧螺春晴 at 2017-05-02 23:15:32
那么低的退火温度，话说都是顺机引物了，怎么算出来的退火温度啊。另外退火温度太低了你的引物10个碱基里有7个GC估计都成引物二聚体了吧。提高退货温度到60度看看吧
...

因为引物序列知道，用(G+C)×4+(A＋T)×2估算的～，我今天提高退火温度再试试

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4楼2017-05-03 08:08:07

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