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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 枯草芽孢杆菌芽孢基因Spo0A及上下游序列（3200bp）的测定问题
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我是VV07072

新虫 (初入文坛)

[求助] 枯草芽孢杆菌芽孢基因Spo0A及上下游序列（3200bp）的测定问题 已有1人参与

枯草芽孢杆菌是我自己筛选的，没有做全基因测序。现在我要对这个菌做芽孢基因的敲除，因此我需要先得到这个菌的Spo0A及上下游序列（用来构建敲除载体），再来设计引物。所以，我先参照别人论文中的引物以及PCR条件进行，但是一直PCR不出我要的片段。已经确定提取出来了总DNA，现在应该如何进行下去？求帮助！
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1楼 2017-04-19 17:12:12
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-20 07:44:35
测个全基因组吧，便宜实惠。小片段文库+hiseq测1G数据1000元就ok了。当然你也可以选择扩侧翼序列，有许多方法，工作量大，花费也不低

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做一个阳光、开朗的小和尚
2楼2017-04-20 00:23:58
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我是VV07072: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-04-22 11:19:54
附件里是枯草芽孢杆菌168在该基因附近的序列。

因为你的菌可能和它的区别较大，你可以根据该基因内部（或上下游基因）的序列保守区域设计引物（可能需要简并引物）来做pcr扩增并测序。

当然楼上说的全基因组测序自然是个选择，有这个预算的话就做吧，估计迟早会在关于这个菌的其他性质上用到，一劳永逸了。
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  • 附件 1 : sequence.gb
    • 2017-04-20 16:03:09, 28.71 K
3楼2017-04-20 16:07:14
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我是VV07072

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuweitao at 2017-04-20 16:07:14
附件里是枯草芽孢杆菌168在该基因附近的序列。

因为你的菌可能和它的区别较大，你可以根据该基因内部（或上下游基因）的序列保守区域设计引物（可能需要简并引物）来做pcr扩增并测序。

当然楼上说的全基因组测 ...

尴尬的是，老板觉得没必要做全基因组测序。谢谢你的建议！更尴尬的是，实验室没有人做分子学实验，所以我没法请教我设计的引物是否合适
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4楼2017-04-22 11:17:16
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我是VV07072

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2017-04-20 00:23:58
测个全基因组吧，便宜实惠。小片段文库+hiseq测1G数据1000元就ok了。当然你也可以选择扩侧翼序列，有许多方法，工作量大，花费也不低

我目前已经将菌寄到生工，并提供我参考别人论文中的引物，让他们帮我进行PCR和测序，至于全基因测序，老板并不打算做。谢谢你！
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5楼2017-04-22 11:19:21
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