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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于pet28a的宿主问题
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cpu2004

金虫 (小有名气)
我做实验的时候基本上是直接转化到BL21的，用CaCl2做感受态的时候过夜，5%转接2h，下面一样，感受效率挺高的。当然，我这样做的时候插入序列最长只有1700bp。其它大片段我还是用克隆+亚克隆的方法做的。

[ Last edited by cpu2004 on 2009-6-5 at 22:17 ]
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11楼2009-06-05 22:14:00
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
先把pET28a转到DH5a里面，质粒鉴定无误后抽提质粒再转BL21表达蛋白
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12楼2009-06-06 15:03:23
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stfo

铜虫 (小有名气)
一般是先转DH5a，不要先转BL21，不太好的，呵呵
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13楼2009-06-06 15:53:25
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2008116068

木虫 (著名写手)
我们实验室一般用DH5a，效果还不错，不过操作也比较重要
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只要踮起脚尖，就离太阳更近一点！！！
14楼2009-06-06 16:16:36
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
p28a和bl21（DE3）是我们实验室常用的表达载体和宿主菌，感觉重组p28转化BL21（de3）效果还是很好的。
如果你的感受态不是买的而是以前做的保存下来的，建议自己重新做感受态试试，一般做好感受态4度保存8-10小时后转化效果最好。
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Thank-you，so-blue.
15楼2009-06-06 17:26:10
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月月大可

木虫 (著名写手)
你做完连接一定要先转化克隆菌，不要直接转表达菌，很难长出来。在克隆菌中鉴定阅读框正确后在转化表达菌。
虽然使用的pET28a同时拥有T7启动子和lac双重控制，但是还是会有些本底表达，因为平常使用的蛋白胨中都还有及少量的乳糖，这样就会开启启动子，是目的基因表达。这样细胞很有可能受不了。
而你使用质粒转化转化效率要比连接产物高很多。
曾经我想过要在培养基中加入0.5%的葡萄糖抑制本底表达，这样连接产物直接转表达菌可能会长出来，只是想过还未验证过。
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16楼2009-06-07 10:57:17
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月月大可

木虫 (著名写手)
刚刚看到楼主是生物物理学，是不是在生物物理所？
我在！

[ Last edited by 月月大可 on 2009-6-7 at 11:01 ]
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17楼2009-06-07 10:59:46
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
先转到JM109，DH5a中，再大量提质粒，再转到B21中。实验室转农杆菌也是这种方法。
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18楼2009-06-07 12:05:26
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xieyue2005

新虫 (初入文坛)
我们实验室也是先将连接产物转入DH5a，再抽取阳性克隆菌质粒转BL21，使用表达载体PET32a，效果较好。
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19楼2009-06-08 00:40:45
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xieyue2005

新虫 (初入文坛)
你将构建好的表达载体先转入DH5a，然后提取质粒再做一下PCR和酶切鉴定，若效果都好，那你再转BL21，因为BL21是pet系列表达载体最好的表达宿主菌。
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20楼2009-11-14 18:02:20
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