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houchenxi金虫 (初入文坛)
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[求助]
pcr电泳条带弥散
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想要p出一个4kb的目的基因，一直p不出来，请大神帮帮忙 我用的cDNA是从RPE细胞内提取出来的，用的聚合酶是方塔高保真酶 体系如下（单位：微升）： 灭菌miniQ：2.8 模板cDNA：2 5*enhancer：2 5*SFbuffer：2 引物1: 0.4 引物2： 0.4 dNTPmix：0.2 方塔高保真酶：0.2 其中引物都稀释到10vm， 温度设置： 预变性 95度 2min 变性 95度 10s 退火 50~69 都试过 20s 延伸 72度 2min 彻底延伸 72度 10min 中间三个步骤30个cycle 跑胶结果是弥散的（图一）： 为了证明我的体系是没错的，我用师兄的引物，其他都用我自己的做了一次，发现是能够p出来的（图二） 之后为了证明引物没有降解，我使用琼脂糖凝胶电泳（1%，加4微升EB），引物：10*loading buffer：dd水=2:1:7.跑了10分钟，marker右边两个是现在在用的引物（图三）。 引物已经重新设计过一遍了，连接片段和文献上的相同， 其实刚开始还是有非特异性条带的（图四），现在连非特异性的都没了，实在不知道为什么  请大神们指教  图一.jpg  图二.jpg  图三.jpg  图四.jpg |
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