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[求助]
求助诸君，新手TRIzol法提取RNA，RNA浓度太低，纯度也太低，怎么破 已有4人参与
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步骤： 1、细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。 2、12,000rpm 离心 10min，弃沉淀。 3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下颠倒混匀后常温放置15min。 4、4℃ 12,000g 离心 15min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中 6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置10min。 7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（先加无酶水再加乙醇配置而成，会不会有问题？） 9、 4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、用 10ul DEPC水溶解RNA样品。 其中我最后一步用10ul的DEPC水溶解，得到的RNA浓度才90多点ng/ul 浓度也不高，求助诸君啊啊啊  E0F478D859AE9A00BB4343FCC9FF71EF.jpg  E8B6ACCA6880FBD84EC6478AE9E3EE9A.jpg@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
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【答案】应助回帖
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1.取1.5ml Eppendorf离心管，加入1ml Trizol试剂（试剂需4℃保存）和2颗机械破碎用珠子，置于冰上备用； 2.取适量组织（＜10mg）加入步骤1 Eppendorf离心管中； 3.机械破碎组织（仪器名及设定）； 4.室温静置3~5min； 5.加入200ul氯仿，振荡混匀，使用Vortex需混匀15s； 6.室温静置3min； 7.4℃，12000rpm离心15min； 8.转移上清（约450~470ul）至新的Eppendorf离心管中； 9.加入0.7~1倍体积的异丙醇，手动上下颠倒混匀10~15次； 10.-20℃静置30~60min； 11.4℃，12000rpm离心10min，弃上清； 12.用75%乙醇（需用DEPC水配制，现用现配）500ul清洗两次，12000rpm离心5min，弃上清； 13.置于生物安全柜内晾干（至白色沉淀透明）； 14.加入25~50ul DEPC水溶解RNA； 15.85℃加热3min； 16.-80℃保存。 这是我的提取方法，不过需要用匀浆仪，一般都能到200以上的浓度 |
33楼2017-04-18 14:12:19
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1.我除了离心以外都是常温操作，有没有问题？哪些是最好冰上操作？2.我后续又通过试剂盒纯化，但浓度变特别低，各位大佬用TRIzol提细菌RNA有没有纯化？3.我的步骤里面有没有哪个顺序不太合适或者时间不合适？ 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2017-03-30 19:55:23
4楼2017-03-30 20:51:57
liyuan110188
新虫 (初入文坛)
- 应助: 2 (幼儿园)
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- 专业: 细胞生物学
5楼2017-03-30 20:52:13