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求助诸君，新手TRIzol法提取RNA，RNA浓度太低，纯度也太低，怎么破 已有4人参与
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步骤： 1、细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。 2、12,000rpm 离心 10min，弃沉淀。 3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下颠倒混匀后常温放置15min。 4、4℃ 12,000g 离心 15min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中 6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置10min。 7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（先加无酶水再加乙醇配置而成，会不会有问题？） 9、 4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、用 10ul DEPC水溶解RNA样品。 其中我最后一步用10ul的DEPC水溶解，得到的RNA浓度才90多点ng/ul 浓度也不高，求助诸君啊啊啊  E0F478D859AE9A00BB4343FCC9FF71EF.jpg  E8B6ACCA6880FBD84EC6478AE9E3EE9A.jpg@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw |
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feilr
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我们操作没有你的第二步，然后加水溶解是水会先预热到60度，或者60度孵育两分钟帮助溶解，其他步骤差不多，希望对你有帮助 发自小木虫IOS客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
DTCZ16楼2017-04-01 07:07:25
zhouxiaohan
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我之前提的都是细胞的，异丙醇离心后如无明显沉淀，说明RNA量很少，你可以提高下你的菌量再试一下。另外，你的260/280值太低，我觉得有可能降解了。 发自小木虫Android客户端 |
14楼2017-03-31 22:29:52
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RNA易降解，尽量不要放在常温，放在冰上。另外，异丙醇沉淀的时候，我们实验室是放在-20℃的。 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
15楼2017-04-01 01:29:46
yun920228
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17楼2017-04-01 07:28:26
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有两个问题，第一个是加完异丙醇后离心是否看到明显沉淀？如果有看到沉淀说明rna量是比较多的。第二个是你测浓度的数据中，260/280才1.23，应该是2.0左右，这也可能导致浓度的数据不对。你再重新测一下，如果还是1.23左右，考虑跑个胶看是否降解吧。 发自小木虫IOS客户端 |
7楼2017-03-30 23:39:46
mengfanbo
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我们的方法：第5步之后先加2ul糖原混匀，再进行第6步。第6步里的室温改成-20度静置半小时后再进行下一步。 发自小木虫IOS客户端 |
18楼2017-04-01 07:52:08
21楼2017-04-01 20:07:13
25楼2017-04-02 09:30:46
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1.我除了离心以外都是常温操作，有没有问题？哪些是最好冰上操作？2.我后续又通过试剂盒纯化，但浓度变特别低，各位大佬用TRIzol提细菌RNA有没有纯化？3.我的步骤里面有没有哪个顺序不太合适或者时间不合适？ 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2017-03-30 19:55:23
cuijiaqi_92
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