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大头妞妞

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 5185374
注册: 2016-10-31
专业: 水产生物免疫学与病害控制

[求助] 签了几天的到、终于派上用场了已有1人参与

从第一次实验到这次实验，参数从未改过、阈值和基线仍是这个鬼样子、想知道具体是怎么回事、可以告诉我吗、protocol是师姐给的、我每一个实验结果看到的阈值都是这样、想知道具体怎么破、谢谢了、下次有金币还会补上

@飞约疯人院发自小木虫IOS客户端

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1楼 2017-03-30 16:24:05

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

日光海

铜虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 1508.7
红花: 1
帖子: 87
在线: 60.3小时
虫号: 2612459
注册: 2013-08-23
专业: 水产生物免疫学与病害控制

【答案】应助回帖

双蒸水和去离子水都可以，关键在于定量pcr中的baseline一般都是默认生成的，是根据所有监测的反应孔中的荧光强度变化按照默认算法自定的一个阈值。这个是可以手动调的，至少我们实验室当时用的LightCycler480是可以自己手动调整以避开背景反应的干扰的。PCR中，即使不加模板，但由于引物之间会有错误配对，即使不配对的情况，单链引物自身亦是超短模板，标准模板不存在情况下，引物自生的配对扩增会更加频繁，因此引物扩增的超短双联DNA也会产生荧光信号（比如普通PCR中的引物二聚体的产生）。所以你就会看到很多非标准S型曲线的扩增荧光曲线，但机器本身识别不了这个，仍会把这个看作是PCR扩增，所自动生成的baseline会把这一部分荧光强度也算进去。具体的，要做很多优化和分析了，引物设计时一定要避免这个，尤其是在高精度的定量中。