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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » [求助] PCR的条带P出来不亮？
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erictan2046

铜虫 (正式写手)

[交流] [求助] PCR的条带P出来不亮？

本人遇到的问题：

（1）本人在实验当中遇到PCR反应P出来的条带都不是很亮，除了第一次PCR的条带有稍微亮一些的！PCR 10x PCR buffer含（Mg2+）的，起初加进去能跑出很亮的条带，由于把那小瓶含Mg离子的buffer 用完了，当单独加入了MgCl2 PCR的时候，现在我PCR的条带就不亮了！Mg2+优化条件，有哪位高手能帮忙一下提供资料？

（2）Takara宝生物的Taq聚合酶高保真的怎么稀释？？？听师姐说酶的母液都需要稀释的！

以上2个问题希望能得到各路高手的帮忙得到满意的解答。
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1楼 2008-12-30 10:27:29
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j2

木虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度变化非常敏感，Mg2+浓度过低时，酶的活力显著降低，但过高又会催化非特异性扩增，适当浓度的MgCl2能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性。
我跟你相反，单独加MgCl2的出来了……
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
2楼2008-12-30 10:48:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
1、每一种Taq酶对Mg的浓度依赖性不同。一般以2.5mM为start point，以0.5mM为梯度上下摸
2、Taq酶不要稀释，这是错误的做法，稀释之后酶很容易失活
3、为何大家都要用takara的东西呢……太垃圾了……Promega、Invitrogen的酶都比这个好用太多倍了，扩增能力根本就不是一个档次的。用takara的东西做不出实验是很常见的
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3楼2008-12-30 13:31:07
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jasco

木虫 (正式写手)
[quote]Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-12-30 13:31:
1、每一种Taq酶对Mg的浓度依赖性不同。一般以2.5mM为start point，以0.5mM为梯度上下摸
2、Taq酶不要稀释，这是错误的做法，稀释之后酶很容易失活
3、为何大家都要用takara的东西呢……太垃圾了……Promega、In ... [/quote

竟然还有同学稀释酶来用，FT
我也不喜欢takara的酶，稍微困难点的pcr他就不行了
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4楼2008-12-30 16:58:10
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广州东盛

用我家的酶吧，TAQ酶很经典的
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5楼2008-12-30 17:21:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
==b
广告……
普通PCR，用Promega的GoTaq，我还没遇到做不出来的实验
需要一点点保真度的，考虑用混合酶，或者修饰的酶
要很高保真度的，就上PfuUltra II吧……
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6楼2008-12-30 18:12:08
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cjl2008bio

铜虫 (初入文坛)
酶实在要稀释的话用TE稀释，工作浓度就可以
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7楼2008-12-31 10:43:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by cjl2008bio at 2008/12/31, 10:43:
酶实在要稀释的话用TE稀释，工作浓度就可以

错误操作……

稀释了酶之后，甘油量降低，酶容易结冰，反复冻融一下子就挂掉
另外，兄台该不会不知道EDTA能螯合镁离子吧……
尽管最后EDTA的量不会很多，但多少都有影响的
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8楼2008-12-31 12:34:36
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cjl2008bio

铜虫 (初入文坛)
   这样哦  我是觉得稀释的酶放4度的话，工作浓度的TE能抑制所受蛋白酶污染的效果。同时也有温和的ph。  
当然了，酶不稀释最好了。
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9楼2009-01-01 11:37:24
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