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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因全长验证
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

[求助] 基因全长验证 已有3人参与

用高保真酶做基因全长验证时，一开始全都是拖带，后来改变条件后，跑出条带了，却不是我的目的带，因为我的目的带只有393bp左右，跑出的条带有将近600bp，请问大家有谁遇到过这种情况以及遇到这种情况该如何解决，谢谢@biostar2009
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1楼 2017-03-25 22:08:30
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2017-03-26 23:36:20
你扩增的引物是cDNA水平还是基因组水平的，如用cDNA水平的引物 且基因组有内含子，得到的就是比在cDNA上的大小要大，如果是用基因组水平的引物做验证，拖带表示引物的特异性不好，重新设计引物或者试试做touchdown  ...

首先谢谢您，我用的是cDNA水平的引物，然后模板也是用RNA反转录得到的cDNA,理论上是没有内含子的，昨天把延伸时间缩短了，分别为45s和30s，结果还是只有在600bp左右有带，这个到底是什么问题呀，

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11楼2017-03-27 10:03:29
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
求大神

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2楼2017-03-26 12:04:10
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
求大神

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3楼2017-03-26 12:04:48
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莫等闲111

版主 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-27 06:32:36
跑出的条带有将近600bp是引物二聚体，事实上你的条带并没有跑出来；个人建议：模板浓度要合适不要过多也不要过少，自己计算好；另外退火温度自己最好做一个梯度。
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站内信：http:///muchong.com/bbs/box.php评分及查找应助者发送的密码http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7465070&fpage=1
4楼2017-03-26 12:10:28
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