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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做完重叠pcr之后电泳出现了非特异性的条带
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阿森旦

新虫 (初入文坛)

[求助] 做完重叠pcr之后电泳出现了非特异性的条带

求讲解！本科的一个大创项目！其实我也不是很明白！这次是把mcherry和cbm3的基因一起做overlap 然后做了一个梯度pcr 但是电泳之后出现了两个条带！请问有大神能帮忙分析一下可能出现的原因吗～该怎么解决呢！谢谢啦！

做完重叠pcr之后电泳出现了非特异性的条带


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1楼 2017-03-22 23:05:02
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
可能是引物特异性不高哦，或者把退火温度加大。我也曾经出现过，将大小对的条带切下来连T载体。测序对了，就不用再overlapping pcr了

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2楼2017-03-22 23:36:11
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阿森旦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 秉秉的法兰西 at 2017-03-22 23:36:11
可能是引物特异性不高哦，或者把退火温度加大。我也曾经出现过，将大小对的条带切下来连T载体。测序对了，就不用再overlapping pcr了

哇！谢谢建议！会尝试的！还想请问一下这个温度已经做到70℃了，还要往上做梯度吗？还有这个电泳图条带后都有一条痕迹 这算是拖尾了吗？？？

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3楼2017-03-22 23:42:16
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
退火温度70？是gc含量太高了吧。一般引物退火温度不会这么高啊。你两条引物的退火温度之间相差多少？

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4楼2017-03-23 00:02:07
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秉秉的法兰西

新虫 (小有名气)
overlapping的重叠序列最好大于15bp。你要实在不行，你试试62度退火。大多数情况下62度就能p出来，尽管引物序列很长

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阿森旦
5楼2017-03-23 00:05:48
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半天云

新虫 (初入文坛)
目的条带对切胶回收就可以了
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6楼2017-03-26 18:45:01
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阿森旦

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 秉秉的法兰西 at 2017-03-23 00:05:48
overlapping的重叠序列最好大于15bp。你要实在不行，你试试62度退火。大多数情况下62度就能p出来，尽管引物序列很长

哇！谢谢你！好久没回来看！都快忘了这个帖了！感恩！

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7楼2017-06-07 22:02:07
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