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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求大神指导这个PCR程序是如何设置的
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] 求大神指导这个PCR程序是如何设置的已有2人参与

如题，最近读的一篇文献里我的目的片段扩增程序是这样的：SSU rDNA was amplified by PCR in a total volume of 50ul. The thermal cycle parameters consisted of 40 cycles of 30 s at 94℃, 30 s at 50℃ and 120 s at 72℃, followed by 5 min at 72℃ for final extension. Partial SSU rDNA sequences were obtained by amplification with the primer pairs s14F3-s17 and s14F3-sB (primers described in Pawlowski, 2000). The obtained PCR products were used for reamplification with the primer pairs s14F1–s17 and s14F1–sB, using the same thermal cycle parameters during 25 cycles.

引物位置如下图

那么问题来了，在 amplification 的时候，s14F3-s17 and s14F3-sB （同理， s14F1–s17 and s14F1–sB）这两对引物是同时加到50ul的PCR体系里吗？

之前没见过这种写法的，实在搞不明白这个PCR程序是怎么设置的，还请各位大神指导一二，多谢！！！

求大神指导这个PCR程序是如何设置的
捕获.PNG
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越努力越幸运
1楼2017-03-20 15:38:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
已写得很明白，第一次40个循环扩增引物 s14F3-s17 和s14F3-sB 。
第二次用第一次的产物，同样体系，25个循环扩增引物s14F1–s17 和 s14F1–sB
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8楼2017-03-21 16:42:48
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六行911

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得应该和8楼所说一样，用第一次的扩增产物当第二次的模板，这样可以起到放大的作用类似巢式pcr的作用，你可以先分管做，再合管做，可能是针对你的模板只能特异性的扩增出其中一个片段，后面加入巢式再去做放大片段，最后的pcr产物做测序或者后续酶切克隆等试验。
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不负此生
10楼2017-03-21 17:42:08
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普通回帖

痞子无敌

金虫 (正式写手)
问题是 这两对引物分别用来扩增什么

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当你当你的眼睛眯着笑
2楼2017-03-20 22:11:36
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 痞子无敌 at 2017-03-20 22:11:36
问题是 这两对引物分别用来扩增什么

扩增18s的一个片段
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越努力越幸运
3楼2017-03-21 08:09:01
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
去找那篇2000年的文献啊

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当你当你的眼睛眯着笑
4楼2017-03-21 10:43:48
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
然后，看你的目的产物是什么，再结合引物序列，我觉得…应该能搞懂…

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当你当你的眼睛眯着笑
5楼2017-03-21 10:45:08
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 痞子无敌 at 2017-03-21 10:45:08
然后，看你的目的产物是什么，再结合引物序列，我觉得…应该能搞懂…

e,,,
请问您能直接告诉我以您的理解，我的这个PCR程序应该是怎么样的吗？
我是想了很久，跟旁边的同学都讨论无果才过来发帖子的，而您前面两个提示并没有让我更明白，谢谢。
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越努力越幸运
6楼2017-03-21 13:44:23
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AMAX-Oliver
7楼2017-03-21 14:08:38
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bbqlhb at 2017-03-21 16:42:48
已写得很明白，第一次40个循环扩增引物 s14F3-s17 和s14F3-sB 。
第二次用第一次的产物，同样体系，25个循环扩增引物s14F1–s17 和 s14F1–sB

请问是把引物s14F3-s17 和s14F3-sB同时加到 50ul体系中，进行40个循环吗？

我没有见过体系里同时加一对半巢式PCR引物的反应，所以不敢确定，谢谢
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越努力越幸运
9楼2017-03-21 16:50:28
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