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未知基因的克隆与表达 已有2人参与
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| 现在在做无忧树中某合酶基因的克隆，该基因序列在无忧树中没有报道过。现在根据已经报道了的香脂树同类酶基因序列（1800bp左右）设计引物做PCR，得到了3个大小不同的片段（800bp、1500bp和2000bp左右）。与参考序列相似度92%，是不是大概是对的？接下来要做原核表达，有一个让我很困惑的问题，就是我不知道扩增到的这几个片段是不是完整的，如何得到完整序列？如果不完整会不会表达不出来蛋白？刚开始做分子实验，还有很多不懂，请各位有经验的前辈指点一下，谢谢啦！ |
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2楼2017-03-07 01:56:24
3楼2017-03-07 09:05:03
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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我没做过未知基因的扩增，想和楼主探讨一下。 关于是否是完整片段，楼主不妨分析一下已知其他物种的同工酶。 分析目的基因在哪一条染色体和哪个位置，分析基因上下游的功能，分析这一种酶家族的基因特点。 其他物种的同工酶活性中心至少应该是大致相同的，蛋白的性质应该相差不大，分析一下氨基酸序列，猜测一下各个区域的功能，亲水区、输水区，刚性结构等等。 参考其他酶的合成代谢机制，糖基化修饰、二硫键，是否有前体、二聚体、多聚体。。。 楼主表达蛋白的最终目的是什么？ 不妨建议楼主重点比对核心功能区域，平行表达已知物种的核心功能区域。 如果目的基因表达蛋白不完整，只要活性中心能够良好发挥作用，也有比较大的意义。 |
4楼2017-03-07 09:13:06
5楼2017-03-07 09:13:27
yoyoisagirl
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