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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)

[求助] 未知基因的克隆与表达 已有2人参与

现在在做无忧树中某合酶基因的克隆，该基因序列在无忧树中没有报道过。现在根据已经报道了的香脂树同类酶基因序列（1800bp左右）设计引物做PCR，得到了3个大小不同的片段（800bp、1500bp和2000bp左右）。与参考序列相似度92%，是不是大概是对的？接下来要做原核表达，有一个让我很困惑的问题，就是我不知道扩增到的这几个片段是不是完整的，如何得到完整序列？如果不完整会不会表达不出来蛋白？刚开始做分子实验，还有很多不懂，请各位有经验的前辈指点一下，谢谢啦！
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活到老学到老
1楼 2017-03-06 20:28:12
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-07 07:28:31
无忧树是真核生物吧？原核表达的时候要去掉内含子，否则会表达出一堆奇奇怪怪的东西出来
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2楼2017-03-07 01:56:24
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-03-07 01:56:24
无忧树是真核生物吧？原核表达的时候要去掉内含子，否则会表达出一堆奇奇怪怪的东西出来

我是用cDNA做模板，这样扩出来就没有内含子了吧
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活到老学到老
3楼2017-03-07 09:05:03
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我没做过未知基因的扩增，想和楼主探讨一下。
关于是否是完整片段，楼主不妨分析一下已知其他物种的同工酶。
分析目的基因在哪一条染色体和哪个位置，分析基因上下游的功能，分析这一种酶家族的基因特点。
其他物种的同工酶活性中心至少应该是大致相同的，蛋白的性质应该相差不大，分析一下氨基酸序列，猜测一下各个区域的功能，亲水区、输水区，刚性结构等等。
参考其他酶的合成代谢机制，糖基化修饰、二硫键，是否有前体、二聚体、多聚体。。。
楼主表达蛋白的最终目的是什么？
不妨建议楼主重点比对核心功能区域，平行表达已知物种的核心功能区域。
如果目的基因表达蛋白不完整，只要活性中心能够良好发挥作用，也有比较大的意义。
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4楼2017-03-07 09:13:06
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
引用回帖:
3楼: Originally posted by 笨笨的云 at 2017-03-07 09:05:03
我是用cDNA做模板，这样扩出来就没有内含子了吧...

没有内含子的
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5楼2017-03-07 09:13:27
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yoyoisagirl

新虫 (初入文坛)
反向pcr，tail pcr，巢式pcr啥的你看看行不行，这些是可以找到片段两端的序列

发自小木虫Android客户端
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6楼2017-03-07 10:42:11
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笨笨的云

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bush119 at 2017-03-07 09:13:06
我没做过未知基因的扩增，想和楼主探讨一下。
关于是否是完整片段，楼主不妨分析一下已知其他物种的同工酶。
分析目的基因在哪一条染色体和哪个位置，分析基因上下游的功能，分析这一种酶家族的基因特点。
其他物 ...

谢谢你的建议，我本来也这么想的，先把拿到的片段做个表达，试试看。我比较过蛋白结构，基本上主要区域都是有的，就是长度都不太一样。
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活到老学到老
7楼2017-03-07 12:37:52
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
引用回帖:
7楼: Originally posted by 笨笨的云 at 2017-03-07 12:37:52
谢谢你的建议，我本来也这么想的，先把拿到的片段做个表达，试试看。我比较过蛋白结构，基本上主要区域都是有的，就是长度都不太一样。...

不客气 我一年多不做了 手痒。。。
建议楼主多表达一个已知酶的功能区域 和未知的目的基因越接近越好 两个基因平行做 比对一下功能活性 可能更有意义
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8楼2017-03-07 13:54:34
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