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小汰宝

金虫 (正式写手)

[交流] in fusion同源臂重组时,同源臂最多可以多长? 已有4人参与

现在要把一段基因构建到目标载体上,并且给基因前面加上T7启动子+lac操纵子+RBS.

目前想到比较稳妥的办法就是把基因构建到含有T7+lac操纵子+RBS的质粒上(比如petdute),然后再把一整段T7+lac+RBS+基因一起P下来,再连接一次到目标载体。

但是也有个想法,不知道能不能实现:就是把基因从最初载体上P下来的时候,前端就加上T7+lac操纵子+RBS的同源臂,并且环P目标载体的时候也给对应的那端加上这个同源臂,实现一步连接。

如此一来,引物为了包括这段同源臂,要在结合区域20bp以外,再加上85bp同源臂,总共100多bp了,不知道这么长的引物和同源臂有没有问题?

snapgene中模拟过了,是可以的,但是实验室没人用过这么长的引物,所以求教~~

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我爱chi辣椒

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
额,推荐看一篇文献Characterization of Stilbene Synthase Genes in Mulberry ( Morus atropurpurea ) and Metabolic Engineering for the Production of
Resveratrol in Escherichia coli。

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A right way maybe not a good way!
4楼2017-03-05 13:17:44
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-05 08:57:40
20bp的同源臂没有问题,如果了解原理的话, in fusion方法同源重组克隆,同源臂越长越好,当然适当长度一般超过15bp即可。100bp长度的引物也还好,就是合成略贵。
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2017-03-05 02:20:08
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firefly22

禁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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3楼2017-03-05 09:36:18
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burma9

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2017-03-05 02:20:08
20bp的同源臂没有问题,如果了解原理的话, in fusion方法同源重组克隆,同源臂越长越好,当然适当长度一般超过15bp即可。100bp长度的引物也还好,就是合成略贵。

您好,我看Infusion 同源重组说明书上写着同源臂是15bp,,同源臂到25bp的话,也可以吗?
5楼2019-01-03 09:12:53
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