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求助大神，分子基础薄弱 引物设计扩不出来!
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我的目的基因序列TTGGACAACGCCTTCCCCTTCGGGACATGCATCAACACGTCCGTCATCCAGAAGCCGGCCTTCCTCGACTTCTTCACCAACCACTTCGACTGGGCCGTCTTCGAGAACGAGCTCAAGTGGTACCACACGGAGGTGCAGCAGGGCCAGCTCAACTACGCCGACGCCGACGCGCTGCTCGCGTTCTGCGACCGCCTGGGCAAGACCGTCCGCGGCCACTGCGTCTTCTGGTCCGTGGACGGCGACGTGCAGCAGTGGGTCAAGAACCTCAACAAGGACCAGCTCAGGTCCGCCATGCAGAGCCGCCTCGAGGGCCTCGTCTCCCGCTACGCCGGCAGGTTCAAGCACTACGACGTCAACAACGAGATGCTGCACGGCCGCTTCTTCCGGGACCGCCTCGGCGACGAGGACGTCCCGGCGTACATGTTCAAGGAGGTGGCGCGGCTGGACCCGGAGCCCGTGCTCTTCGTCAACGACTACAACGTGGAGTGCGGCAACGACCCCAACGCGACGCCGGAGAAGTACGCCGAGCAGGTCGCATGGCTGCAGAGCTGCGGCGCGGTGGTGCGCGGCATCGGGCTGCAGGGCCACGTGCAAAACCCGGTCGGGGAGGTCATCTGCGCCGCGCTCGACAGGCTCGCCAAGACGGGGGTGCCCATCTGGTTCACCGAGCTCGACGTGCCGGAGTACGACGTGGGCCTCCGCGCCAAGGACCTGGAGGTGGTGCTCCGGGAGGCGTACGCGCACCCGGCCGTGGAGGGCATCGTGTTCTGGGGCTTCATGCAGGGCACAATGTGGCGCCAGAACGCTTGGCTCGTCGACGCCGATGGCACCGTCAACGAGGCGGGCCAGATGTTCCTGAATCTGCAGAAGGAGTGGAAG 设计的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位点 EcoRI GC含量57.6% TM值70.1 R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位点 NotI GC含量54.5% TM值68.7 前后引物均加酶切位点和保护碱基 尝试过退火温度58-64均没有P出来目的条带还尝试过55度也没有p出来 不知道是什么原因 求各位大神指点，小妹不胜感激！ |
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艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
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5端和3端加保护碱基是指上游引物和下游引物前面加保护碱基，主要是因为内切酶识别特定的DNA序列的时候还要占据识别位点两边的一些碱基，这些碱基对内切酶同DNA双链结合并发挥切割作用有很大影响的，直接暴露在末端的酶切位点不容易被酶切开，所以在设计引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 发自小木虫Android客户端 |
100楼2017-07-10 10:31:25
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艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-26 08:55:19
艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-26 08:55:19
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设计的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位点 EcoRI GC含量57.6% TM值70.1 R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位点 NotI GC含量54.5% TM值68.7 你的引物设计的有问题 比如说R:5端 加酶切位点前后都加了保护碱基 ，而且你的保护碱基貌似也不对，有相应的表的，http://wenku.baidu.com/link?url= ... wp-DAwczvXc81arqjsy； 我感觉可以设计成这样R：5- AAGGAAAAAAGCGGCCGC CTTCCACTCCTTCTGC 3-；同理F也一样。 另外注意 (1)酶及其浓度； (2)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一； |
5楼2017-02-25 18:00:54
7楼2017-02-25 18:08:15
简单回复
低价核磁9楼
2017-02-25 18:10
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巨兽10楼
2017-02-25 18:11
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艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
重温旧游13楼
2017-02-25 18:18
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艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
^_^ 发自小木虫IOS客户端
朝都14楼
2017-02-25 18:27
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艾喵喵(金币+1): 谢谢参与
好 发自小木虫Android客户端