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lauren180木虫 (著名写手)
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求助：关于同源重组目的基因的长度问题
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| 做基因敲除时构建重组DNA时，部分目的基因＋抗性基因＋部分目的基因，那么部分目的基因的长度多少时同源重组率高？我看文献有几百BP的，有上千的，有的甚至刚一百BP. |
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基因打靶(gene targeting)技术，通过在转染细胞中发生的外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组(homologous recombination)，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。 基因打靶的分子基础是，两条具有同样或类似核苷酸序列的同源DNA分子之间发生的遗传信息的重组事件。这也就是说，基因打靶的一个基本条件是，在外源打靶基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列。 基因打靶的基本过程包括如下几个步骤： ①首先是将要整合到受体细胞核基因组目标座位的外源打靶基因，以及位于打靶基因两侧与内源目标基因同源的DNA片段，克隆在具有选择性标记基因(例如 neo)的载体分子上，构成专用的基因打靶载体(gene targeting vector)； ②选用适当的核酸内切限制酶切割基因打靶载体，使之线性化后再用来转化受体细胞。由于外源打靶基因的两侧，与内源核基因组上的目标基因或座位之间存在着同源的DNA序列，因此当线性化的载体DNA被导入受体细胞之后，两者便会彼此配对； ③此时在重组酶RecBCD的作用下，两条同源DNA的相同部位便会相继发生单链断裂、链的交换、磷酸二酯键的形成和缺口重新封闭等一系列变化，并最终完成同源重组，实现外源基因在核基因组DNA上的定点整合。 影响基因打靶效率因素： 基因打靶的效率取决于DNA同源重组的频率，它是与两条重组DNA分子之间的同源序列的长度密切相关的。基因打靶所需求的DNA同源性的有效长度为25bp。在哺乳动物细胞中，当DNA同源性的有效长度介于259～1800bp之间时，同源序列越长，基因打靶的效率也就越高。DNA同源性有效长度在2kb以上时，基因打靶的效率进一步提高，同源程度为14kb时，达到最高值；实验还观察到，当 DNA同源序列长度不到 200bp时，基因打靶的效率则会明显地下降。 生物体内的基因重组包括同源重组和非同源重组两种不同的类型。已发现在哺乳动物细胞中，也存在着类似于大肠杆菌重组酶RecA和RecBCD，而且在基因重组研究中还发现了一段能被RecBCD酶特异性识别的DNA序列，即chi位点。若在目标基因两侧加上chi位点，便可使重组效率提高50多倍，从而也就有效地提高了基因打靶的效率。 由于DNA分子的末端是重组酶的有效底物，所以使用线性化的基因打靶载体转染受体细胞，可以有效地提高基因打靶的效率。 |
9楼2008-12-22 13:02:47
lauren180
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根据同源重组过程中外源打靶基因在核基因组上整合的结果，可将基因打靶区分为插入型和置换型两种不同的形式(图8-10)。 在插入型基因打靶中，两条同源DNA分子之间只发生一次交换，即一次同源重组，打靶基因便插入到目标基因的序列中。 置换型基因打靶的分子机理比较复杂，它涉及到在打靶基因与目标基因之间发生两次紧密连锁的同源重组事件。目前最普遍使用的置换型基因打靶的方式是，用完全失活的或无效的打靶基因，取代核基因组上的野生型的目标基因。这种基因打靶技术特称为基因剔除(gene-knockout)，可以比较容易地检测基因的功能。 其主要的应用有如下几个方面： 第一，能够将经体外修饰改造的突变基因或某种新的外源基因，取代受体细胞核基因组上的目标基因，使基因组获得新的遗传信息，以便使科学工作者能够相当有效地检测基因的功能。 第二，也可以在核基因组的目标基因序列附近，插入一个具相同调控序列的同源基因拷贝。如此既可形成重复基因，提高表达效率和相关的蛋白质产量，又可能不会破坏目标基因及其邻近基因的功能。 第三，还可以在核基因组内部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是单碱基定点突变等，从而达到抑制或纠正目标基因的功能，为遗传疾病的基因治疗提供技术途径。 |
10楼2008-12-22 13:20:00
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