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Nigori

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[交流] 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验已有2人参与

实验材料 核苷酸

试剂、试剂盒：浓氨水、TBE、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、TEMED、尿素、过硫酸铵、TE

仪器、耗材：真空旋转蒸发仪、电泳仪

实验步骤

1. 用浓氨水将合成的寡核苷睃从可控孔度玻璃拄上洗脱下来。于55℃加热5 h 以上。

2. 样品移至离心管中，在Speedvac真空旋转蒸发仪中冻干，沉淀用0.2 ml 的水重悬。

3. 装好灌胶装置，准备合适的凝胶溶液（表1）。对于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝胶，在一个真空过滤瓶中棍合下列成分：

（1）25.2 g 尿素（终浓度7 mol/l）

（2）6 ml 10×TBE 电泳缓冲液

（3）40%丙烯酰胺/2%亚甲双丙烯酰胺溶液（所需量）

（4）加水至60 ml

（5）脱气10 min，加入200 μl10%的过硫酸铵及30 μl 的TEMED。混合后灌胶，室温下让胶聚合30 min 以上。

4. 拔去梳子，将凝胶板固定在电泳槽上，用1×TBE下缓冲液注满上层及下层槽。

5. 加样前用2×甲酰胺加样缓冲液将样品作对倍稀释。

6. 每一个2 cm×1.6 mm 孔中可以加入2 μmol 合成量的25%。

7. 得到一个清哳的结果约需10 μg（50 μl 重悬样品+50 μl 2×甲酰胺加样缓冲液=每孔100 μl）。

8. 临加样前用移液器上下吹打TBE缓冲液数次以彻底洗涤样品孔。

9. 加样，在约5 V/cm2电压降下电泳至溴酚蓝到达胶底部。

10. 将凝胶板从电泳槽中取出，水平放置，撬开上层板。

11. 用塑料膜覆盖凝胶，将板翻转，将凝胶的一角揭离玻璃板，放在塑料膜上，再用另一张塑料膜覆盖凝胶。

12. 将凝胶放在带荧光指示剂的薄层层析板上，用短波紫外灯跟踪观察条带，条带将在绿色背景下显示暗迹。

13. 一个干净的解剖刀将条带直接切下或用墨水标记后切出，剥去塑料膜，将胶条转移至离心管中。

14. 每2 cm 的胶条加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸钠，室温下在旋转揺床上洗脱过夜。

15. 将溶液转移至一个干净的离心管中，不要带入丙烯酰胺碎片。

16. 用等体积的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，样品用TE缓冲液或水重悬。

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