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wuqianqian

新虫 (初入文坛)

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专业: 临床微生物学检验

[求助] 新设计的引物怎么都p不出来已有4人参与

新设计引物跑PCR失败，我的流程是95℃ 5min,95℃ 50s,50度30s,72℃1min循环60次，72℃最后延伸10min,摸了50℃ 54℃ 56℃都失败了，我的目的片段是1000bp，求解啊，希望各位大神能指导一下，谢谢！

@biostar2009 @飞约疯人院 @youlinglyw @wizardfan 发自小木虫Android客户端

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枯草芽孢杆菌PCR扩增不出来的问题已经有16人回复

1楼 2017-02-10 09:43:58

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ksws0465326

金虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

p不出来有很多因素，1你用的模板是什么是质粒还是基因组DNA，2加入模板的量的多少，过多或过少都会影响成功率，具体可以参照你使用的酶的说明书，3退火温度可以参照TM值，但是不是绝对的，常用温度50-60，有时40几度也可以出条带，4目标条带1kb，延伸72度时可以放宽时间稍微长一点儿1min10sec或更长，因为说明书写1kb／min，那是理论参考，实际操作可以加长一些，5引物是否保证正确，反向引物容易出错，可以添加一阳性对照，用此引物肯定能p出条带的，来确保反应体系没问题，6循环数一般没必要60次吧。。。有点儿太多了，一般大多数情况下25-40次足可以p出条带了