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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新设计的引物怎么都p不出来
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wuqianqian

新虫 (初入文坛)

[求助] 新设计的引物怎么都p不出来 已有4人参与

新设计引物跑PCR失败，我的流程是95℃ 5min,95℃ 50s,50度30s,72℃1min循环60次，72℃最后延伸10min,摸了50℃ 54℃ 56℃都失败了，我的目的片段是1000bp，求解啊，希望各位大神能指导一下，谢谢！

新设计的引物怎么都p不出来


@biostar2009 @飞约疯人院 @youlinglyw @wizardfan 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-02-10 09:43:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
p不出来有很多因素，1你用的模板是什么是质粒还是基因组DNA，2加入模板的量的多少，过多或过少都会影响成功率，具体可以参照你使用的酶的说明书，3退火温度可以参照TM值，但是不是绝对的，常用温度50-60，有时40几度也可以出条带，4目标条带1kb，延伸72度时可以放宽时间稍微长一点儿1min10sec或更长，因为说明书写1kb／min，那是理论参考，实际操作可以加长一些，5引物是否保证正确，反向引物容易出错，可以添加一阳性对照，用此引物肯定能p出条带的，来确保反应体系没问题，6循环数一般没必要60次吧。。。有点儿太多了，一般大多数情况下25-40次足可以p出条带了
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4楼2017-02-10 11:51:32
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小汰宝

金虫 (正式写手)
你摸的3个温度是退火温度？退货温度不是根据引物tm值来的嘛？

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2楼2017-02-10 11:26:07
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wuqianqian at 2017-02-14 18:19:26
非常感谢您的解答，我开始用的菌液，后来改用基因组DNA，设立阳性对照是能p出来的，但是自己设计的引物却p不出来，循环了30次。
...

阳性对照你怎么做的？是同一种基因组DNA，换了另一对引物做的（p的是同一个基因只是阳性对照的引物p出的条带大小和你设计的引物p出来的条带大小不同）？如果是这样，那可能就是你引物的问题，可能就需要考虑再设计一对引物，如果p的不是同一基因，可比性有但不高，可以再提高下你设计的引物pcr时退火的时间比如55度30s延长到45s或50s等。然后再增加循环数，35或40回。顺便问一下，你这基因组DNA是啥的？植物？还是酵母菌还是啥。。。
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10楼2017-02-15 16:25:18
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普通回帖

wuqianqian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小汰宝 at 2017-02-10 11:26:07
你摸的3个温度是退火温度？退货温度不是根据引物tm值来的嘛？

我是根据自己设计引物的tm值摸的退火温度，都没有p出来

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3楼2017-02-10 11:35:33
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

胶图上传一下，目前能看出来的问题，P2引物太长，
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相信自己
5楼2017-02-13 09:58:04
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wuqianqian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ksws0465326 at 2017-02-10 11:51:32
p不出来有很多因素，1你用的模板是什么是质粒还是基因组DNA，2加入模板的量的多少，过多或过少都会影响成功率，具体可以参照你使用的酶的说明书，3退火温度可以参照TM值，但是不是绝对的，常用温度50-60，有时40几度 ...

非常感谢您的解答，我开始用的菌液，后来改用基因组DNA，设立阳性对照是能p出来的，但是自己设计的引物却p不出来，循环了30次。

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6楼2017-02-14 18:19:26
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wuqianqian

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by l68266152 at 2017-02-13 09:58:04
胶图上传一下，目前能看出来的问题，P2引物太长，

我的胶出除了marker以外，其他全是空白。

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7楼2017-02-14 18:20:00
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wuqianqian at 2017-02-14 18:20:00
我的胶出除了marker以外，其他全是空白。
...

应该猜测是对的，引物太长，想办法缩短一点
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相信自己
8楼2017-02-15 09:29:03
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物设计成一样长短，一样的tm很关键

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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
9楼2017-02-15 09:54:28
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