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请问我pcr产物测序结果显示缺失了引物中的酶切微点，这是引物设计的问题吗 已有3人参与
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想做酶切连接转化，一直没成功后来发现是pcr这边的问题，一开始pcr测序显示突变了上游的酶切位点，然后我怀疑是引物的问题重新设计了上游引物，再次pcr测序却显示下游酶切位点又突变了，而且上游pcr前段也出现了几个bp的突变。 我想请问是我引物的问题吗，还是偶然事件，再p再测？ |
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2楼2017-02-06 23:21:41
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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你这个是直接送的PCR产物进行测序的么？如果是，测序结果的前后和六七十个碱基的可信度不高的，而你的酶切位点基本上也在前后这个区间里，所以看到的突变不一定是真的序列突变，而且测序技术造成的假象，当然也会有出现PCR时发生突变的，大部分是由于目的片段过长，酶保真性较差造成，引物本身应该没太大问题。避免这类繁琐问题的办法，就是构建好载体后挑选克隆测序，毕竟PCR产物在电泳看是单一的条带，但实际上会出现有非特异性条带亦或是突变的的目的条带，让人难以判断测序结果。挑取单克隆相对会更加单一，如果目的载体克隆不容易进行，那么进行T载体克隆也是不错的选择，这个过程在大部分分子克隆实验中往往被省略，但对于你的问题应该是有帮助的，用载体上的引物进行测序，获得的测序结果中可信的部分往往可以完全覆盖你的目的基因，这样你就可以明确的来判断是否是PCR过程发生了突变？还是测序结果出现了误差，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-02-07 00:17:04
5楼2017-02-09 00:33:29