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[交流]
RAPD（随机扩增多态性DNA）分析技术
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实验方法原理 RAPD作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。由于RAPD反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA 5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。 有人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式： （1）5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。 （2）通过两条5’端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。 （3）对基因组DNA分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3’端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全有可能产生RAPD。 实验材料 模板DNA 试剂、试剂盒：寡核苷酸引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、矿物油、电泳所需试剂 仪器、耗材：PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器、Eppendorf管、紫外线观察装置及照相设备 一、 试验条件 1. 药品试剂 （1）模板DNA（10～100 ng） （2）寡核苷酸引物（20 mmol/L贮存液，可向Operon Technologies或Perkin Elmer公司购买，也可以自己合成） （3）0.2 mmol/L dNTPs（必须使用高质量的dNTPs，这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解，因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等） （4）Taq DNA聚合酶（Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut） （5）10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris HCl，pH 8.3） （6）矿物油 （7）电泳所需试剂 2. 仪器设备 PCR扩增仪、电泳装置、微量离心机、微量移液器（1～20 ml和20～200 ml）、0.5 ml Eppendorf管、紫外线观察装置及照相设备。 二、 操作程序 1. 在冰里向无菌的Eppendorf管中加入以下反应物： 水： 14.75 ml 10×缓冲液： 2 ml 10×dNTPs：2 ml 引物（20 mmol/L）：0.2 ml Taq DNA聚合酶 终体积 DNA（10～100ng）：1 ml 石蜡油 ：20 ml 2. 93℃反应2 min后开始如下循环： 93℃变性反应：1 min 36℃退火反应：1 min 72℃延伸反应：1.5 min 经过45个循环后，最后一个循环72℃增加5 min，循环结束后反应产物置于4℃保存。 3. 20 ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。 |
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