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融合PCR引物的设计已有4人参与
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需要在基因A和基因B之间加上一个linker，就是“基因A+linker+基因B”。linker的编码序列为CTGGTGCCGCGTGGTAGC。现在只有基因A和基因B的模板，想通过重叠延伸PCR将3个片段连接起来，但不知道具体该怎样设计引物，求助各位高手提供宝贵意见。 A基因:ATGCCGTTTGTGAATAAACAGTTTAATTACAAGGATCCGGTGAATGGCGTGGACATCGCCTATATTAAAATCCCGAACGCCGGCCAGATGCAGCCGGTGAAGGCATTTAAGATTCATAATAAAATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTTACAAACCCTGAAGAAGGTGACCTGAATCCTCCGCCGGAAGCAAAACAGGTGCCGGTTAGCTACTACGACAGCACCTACCTGAGCACCGATAACGAGAAAGACAATTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGTATTTACAGCACCGATCTGGGCCGTATGCTGCTGACAAGCATCGTTCGTGGCATTCCGTTTTGGGGTGGCAGCACCATTGACACCGAGCTGAAAGTGATTGACACAAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGTAGTGAGGAGCTGAACCTGGTGATTATCGGCCCGAGCGCCGATATTATCCAGTTCGAATGCAAAAGCTTCGGCCACGAAGTGCTGAATCTGACCCGCAATGGCTACGGTAGCACCCAGTATATTCGCTTCAGCCCGGACTTCACCTTCGGCTTCGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTACTGGGTGCCGGTAAGTTTGCCACCGATCCGGCAGTGACCCTGGCCCATGAATTAATCCACGCCGGCCATCGTCTGTACGGCATCGCCATCAATCCGAACCGCGTTTTTAAAGTTAATACAAACGCCTATTATGAGATGAGCGGCCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAGCTGCGCACCTTTGGCGGCCATGACGCCAAATTCATCGACAGCCTGCAGGAAAATGAGTTTCGCCTGTATTATTACAATAAATTTAAAGACATCGCAAGCACACTGAACAAAGCAAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCCAGCCTGCAGTACATGAAGAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGACACCAGCGGCAAGTTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGACAAACTGTATAAGATGCTGACCGAGATCTACACAGAGGACAACTTTGTTAAATTTTTCAAAGTTCTGAATCGCAAAACCTATCTGAACTTTGATAAAGCCGTTTTCAAAATTAATATTGTGCCTAAGGTTAACTATACTATTTACGATGGTTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCAGCAAACTTTAATGGCCAAAATACCGAAATTAATAATATGAATTTTACCAAACTGAAAAATTTCACCGGTCTGTTCGAGTTCTACAAGCTGCTGTGCGTGCGTGGCATCATCACCAGCAAA B基因:GCCTTAAACGATCTGTGCATTAAAGTTAACAACTGGGATCTGTTCTTTAGTCCGAGTGAAGATAATTTCACCAATGATCTGAATAAGGGCGAAGAAATTACCAGCGATACAAATATTGAGGCCGCCGAGGAGAACATTAGCTTAGATTTAATTCAGCAATATTACCTGACCTTCAACTTCGACAACGAGCCGGAGAACATCAGCATCGAGAATCTGAGCAGCGATATCATCGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAACATCGAGCGCTTTCCTAACGGTAAGAAATATGAGCTGGACAAATATACCATGTTTCACTATCTGCGCGCCCAGGAATTTGAGCACGGTAAGAGCCGCATCGCCCTGACAAATAGCGTGAACGAGGCCCTGCTGAACCCTAGCCGCGTGTACACATTTTTCAGCAGCGATTACGTGAAAAAAGTTAACAAGGCCACAGAGGCCGCCATGTTCTTAGGCTGGGTTGAGCAGCTGGTGTATGACTTCACCGATGAGACCAGCGAAGTGAGCACCACCGACAAGATTGCCGACATTACCATCATCATCCCTTATATTGGCCCGGCCCTGAATATCGGTAATATGCTGTATAAAGATGACTTCGTGGGCGCACTGATCTTCAGCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTTATCCCGGAGATCGCAATCCCGGTGCTGGGCACATTTGCACTGGTGAGCTATATCGCCAACAAAGTGCTGACCGTTCAGACCATCGACAACGCACTGAGCAAACGTAATGAAAAATGGGATGAGGTGTATAAATATATCGTGACCAACTGGCTGGCCAAAGTGAATACCCAGATCGACTTAATCCGCAAGAAGATGAAGGAAGCCCTGGAAAACCAGGCAGAAGCCACAAAAGCCATCATCAACTATCAATACAATCAATATACCGAAGAAGAGAAAAATAATATTAATTTTAATATCGATGATTTAAGCAGTAAACTGAATGAAAGTATTAATAAAGCCATGATCAATATTAATAAGTTTCTGAATCAGTGTAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATCCCGTACGGCGTGAAGCGTCTGGAAGATTTCGATGCCAGCCTGAAGGATGCACTGTTAAAATATATTTACGATAATCGCGGCACCCTGATCGGTCAGGTTGATCGCCTGAAAGATAAGGTGAATAACACCTTAAGCACCGATATCCCGTTTCAGCTGAGCAAATACGTGGACAACCAGCGCCTGCTGAGTACCTTTACCGAGTACATCAAAAACATTATTAATACCAGCATCTTAAACCTGCGCTACGAGAGTAATCACCTGATCGACCTGAGCCGCTACGCCAGCAAGATCAACATCGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAGAATCAGATTCAGCTGTTTAACTTAGAAAGCAGTAAAATTGAGGTGATTCTGAAAAATGCCATCGTGTACAATAGCATGTATGAAAATTTCAGCACCAGTTTTTGGATCCGCATCCCGAAGTACTTCAATAGCATCAGTTTAAACAATGAGTATACCATTATTAACTGTATGGAAAATAACAGTGGCTGGAAAGTGAGCCTGAATTACGGTGAGATCATCTGGACACTGCAGGATACCCAGGAGATTAAACAGCGCGTTGTTTTTAAGTATAGCCAGATGATCAACATCAGCGACTATATTAATCGTTGGATTTTCGTTACCATCACCAATAATCGCCTGAACAATAGTAAAATCTATATTAACGGCCGCCTGATCGACCAGAAACCGATCAGCAACCTGGGTAACATTCATGCCAGCAACAATATCATGTTTAAGTTAGATGGTTGCCGCGACACCCACCGCTATATTTGGATCAAATATTTCAACCTGTTCGACAAAGAATTAAATGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAATCAAAGCAATAGTGGCATCCTGAAAGATTTTTGGGGCGACTACCTGCAGTATGATAAGCCGTACTATATGTTAAATCTGTACGATCCTAATAAATATGTTGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTACATGTATCTGAAGGGCCCTCGCGGTAGTGTGATGACCACCAATATCTATCTGAATAGCAGTCTGTATCGCGGTACCAAATTCATCATCAAAAAGTATGCCAGTGGTAATAAAGACAATATCGTTCGTAACAACGATCGCGTGTACATCAACGTGGTGGTGAAGAATAAGGAGTACCGTCTGGCAACAAACGCCAGTCAGGCCGGTGTTGAGAAGATTCTGAGCGCCTTAGAGATCCCGGACGTGGGCAATCTGAGTCAGGTTGTGGTTATGAAAAGCAAAAATGACCAGGGCATTACAAATAAATGCAAGATGAATCTGCAAGATAACAATGGCAATGATATCGGTTTCATTGGCTTTCACCAGTTCAATAACATCGCCAAGCTGGTGGCCAGCAATTGGTACAACCGCCAAATCGAACGTAGCAGCCGCACACTGGGTTGTAGCTGGGAGTTTATTCCGGTTGACGATGGTTGGGGTGAACGCCCGCTGTAA |
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已经做了一个多月了，还是链接不上，引物没有错误，让一个博士看了一下，引物没有设计错误，可就是融合不上，然后买了infusion 试剂盒，还是连接不上。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2017-01-21 09:43:36
2楼2017-01-19 14:59:14
梅太奇阿拉干
木虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:07
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:07
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我不是高手，给你一点提示，你就按引物设计原则分别设计扩增geneA和geneB的引物，只不过是A的下游引物和B的上游引物加上linker序列不就行了吗，注意linker的退火温度和geneA的上游和geneB的下游相近就ok了，这样重叠退火时比较容易扩全长。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-01-19 21:23:01
sky蒲公英
版主 (文坛精英)
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:25
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:25
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是两个片段的连接，分别设计单独基因的上下游引物，然后设计重叠引物，注意前段的连接顺序，设计a的下游重叠引物，b的上游重叠引物，经过pcr，最后用a的上游与b的下游作为引物，以各个基因的linker作为模板，可进行融合。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-01-20 01:39:29