| 查看: 4879 | 回复: 13 | |||
[求助]
融合PCR引物的设计 已有4人参与
|
|||
|
需要在基因A和基因B之间加上一个linker，就是“基因A+linker+基因B”。linker的编码序列为CTGGTGCCGCGTGGTAGC。现在只有基因A和基因B的模板，想通过重叠延伸PCR将3个片段连接起来，但不知道具体该怎样设计引物，求助各位高手提供宝贵意见。 A基因:ATGCCGTTTGTGAATAAACAGTTTAATTACAAGGATCCGGTGAATGGCGTGGACATCGCCTATATTAAAATCCCGAACGCCGGCCAGATGCAGCCGGTGAAGGCATTTAAGATTCATAATAAAATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTTACAAACCCTGAAGAAGGTGACCTGAATCCTCCGCCGGAAGCAAAACAGGTGCCGGTTAGCTACTACGACAGCACCTACCTGAGCACCGATAACGAGAAAGACAATTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGTATTTACAGCACCGATCTGGGCCGTATGCTGCTGACAAGCATCGTTCGTGGCATTCCGTTTTGGGGTGGCAGCACCATTGACACCGAGCTGAAAGTGATTGACACAAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGTAGTGAGGAGCTGAACCTGGTGATTATCGGCCCGAGCGCCGATATTATCCAGTTCGAATGCAAAAGCTTCGGCCACGAAGTGCTGAATCTGACCCGCAATGGCTACGGTAGCACCCAGTATATTCGCTTCAGCCCGGACTTCACCTTCGGCTTCGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTACTGGGTGCCGGTAAGTTTGCCACCGATCCGGCAGTGACCCTGGCCCATGAATTAATCCACGCCGGCCATCGTCTGTACGGCATCGCCATCAATCCGAACCGCGTTTTTAAAGTTAATACAAACGCCTATTATGAGATGAGCGGCCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAGCTGCGCACCTTTGGCGGCCATGACGCCAAATTCATCGACAGCCTGCAGGAAAATGAGTTTCGCCTGTATTATTACAATAAATTTAAAGACATCGCAAGCACACTGAACAAAGCAAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCCAGCCTGCAGTACATGAAGAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGACACCAGCGGCAAGTTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGACAAACTGTATAAGATGCTGACCGAGATCTACACAGAGGACAACTTTGTTAAATTTTTCAAAGTTCTGAATCGCAAAACCTATCTGAACTTTGATAAAGCCGTTTTCAAAATTAATATTGTGCCTAAGGTTAACTATACTATTTACGATGGTTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCAGCAAACTTTAATGGCCAAAATACCGAAATTAATAATATGAATTTTACCAAACTGAAAAATTTCACCGGTCTGTTCGAGTTCTACAAGCTGCTGTGCGTGCGTGGCATCATCACCAGCAAA B基因:GCCTTAAACGATCTGTGCATTAAAGTTAACAACTGGGATCTGTTCTTTAGTCCGAGTGAAGATAATTTCACCAATGATCTGAATAAGGGCGAAGAAATTACCAGCGATACAAATATTGAGGCCGCCGAGGAGAACATTAGCTTAGATTTAATTCAGCAATATTACCTGACCTTCAACTTCGACAACGAGCCGGAGAACATCAGCATCGAGAATCTGAGCAGCGATATCATCGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAACATCGAGCGCTTTCCTAACGGTAAGAAATATGAGCTGGACAAATATACCATGTTTCACTATCTGCGCGCCCAGGAATTTGAGCACGGTAAGAGCCGCATCGCCCTGACAAATAGCGTGAACGAGGCCCTGCTGAACCCTAGCCGCGTGTACACATTTTTCAGCAGCGATTACGTGAAAAAAGTTAACAAGGCCACAGAGGCCGCCATGTTCTTAGGCTGGGTTGAGCAGCTGGTGTATGACTTCACCGATGAGACCAGCGAAGTGAGCACCACCGACAAGATTGCCGACATTACCATCATCATCCCTTATATTGGCCCGGCCCTGAATATCGGTAATATGCTGTATAAAGATGACTTCGTGGGCGCACTGATCTTCAGCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTTATCCCGGAGATCGCAATCCCGGTGCTGGGCACATTTGCACTGGTGAGCTATATCGCCAACAAAGTGCTGACCGTTCAGACCATCGACAACGCACTGAGCAAACGTAATGAAAAATGGGATGAGGTGTATAAATATATCGTGACCAACTGGCTGGCCAAAGTGAATACCCAGATCGACTTAATCCGCAAGAAGATGAAGGAAGCCCTGGAAAACCAGGCAGAAGCCACAAAAGCCATCATCAACTATCAATACAATCAATATACCGAAGAAGAGAAAAATAATATTAATTTTAATATCGATGATTTAAGCAGTAAACTGAATGAAAGTATTAATAAAGCCATGATCAATATTAATAAGTTTCTGAATCAGTGTAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATCCCGTACGGCGTGAAGCGTCTGGAAGATTTCGATGCCAGCCTGAAGGATGCACTGTTAAAATATATTTACGATAATCGCGGCACCCTGATCGGTCAGGTTGATCGCCTGAAAGATAAGGTGAATAACACCTTAAGCACCGATATCCCGTTTCAGCTGAGCAAATACGTGGACAACCAGCGCCTGCTGAGTACCTTTACCGAGTACATCAAAAACATTATTAATACCAGCATCTTAAACCTGCGCTACGAGAGTAATCACCTGATCGACCTGAGCCGCTACGCCAGCAAGATCAACATCGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAGAATCAGATTCAGCTGTTTAACTTAGAAAGCAGTAAAATTGAGGTGATTCTGAAAAATGCCATCGTGTACAATAGCATGTATGAAAATTTCAGCACCAGTTTTTGGATCCGCATCCCGAAGTACTTCAATAGCATCAGTTTAAACAATGAGTATACCATTATTAACTGTATGGAAAATAACAGTGGCTGGAAAGTGAGCCTGAATTACGGTGAGATCATCTGGACACTGCAGGATACCCAGGAGATTAAACAGCGCGTTGTTTTTAAGTATAGCCAGATGATCAACATCAGCGACTATATTAATCGTTGGATTTTCGTTACCATCACCAATAATCGCCTGAACAATAGTAAAATCTATATTAACGGCCGCCTGATCGACCAGAAACCGATCAGCAACCTGGGTAACATTCATGCCAGCAACAATATCATGTTTAAGTTAGATGGTTGCCGCGACACCCACCGCTATATTTGGATCAAATATTTCAACCTGTTCGACAAAGAATTAAATGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAATCAAAGCAATAGTGGCATCCTGAAAGATTTTTGGGGCGACTACCTGCAGTATGATAAGCCGTACTATATGTTAAATCTGTACGATCCTAATAAATATGTTGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTACATGTATCTGAAGGGCCCTCGCGGTAGTGTGATGACCACCAATATCTATCTGAATAGCAGTCTGTATCGCGGTACCAAATTCATCATCAAAAAGTATGCCAGTGGTAATAAAGACAATATCGTTCGTAACAACGATCGCGTGTACATCAACGTGGTGGTGAAGAATAAGGAGTACCGTCTGGCAACAAACGCCAGTCAGGCCGGTGTTGAGAAGATTCTGAGCGCCTTAGAGATCCCGGACGTGGGCAATCTGAGTCAGGTTGTGGTTATGAAAAGCAAAAATGACCAGGGCATTACAAATAAATGCAAGATGAATCTGCAAGATAACAATGGCAATGATATCGGTTTCATTGGCTTTCACCAGTTCAATAACATCGCCAAGCTGGTGGCCAGCAATTGGTACAACCGCCAAATCGAACGTAGCAGCCGCACACTGGGTTGTAGCTGGGAGTTTATTCCGGTTGACGATGGTTGGGGTGAACGCCCGCTGTAA |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有291人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 这个烧脑的引物我设计的对吗，请大神指正
已经有0人回复
- 两个基因融合PCR引物设计
已经有6人回复
- 关于细胞内蛋白定位的问题，和融合蛋白表达的问题，融合PCR问题
已经有5人回复
- 重叠PCR引物设计
已经有4人回复
- 关于融合PCR
已经有7人回复
- 融合PCR
已经有2人回复
- 亚细胞定位。。。
已经有5人回复
- 请问谁做过融合PCR，其中的引物怎么设计？
已经有0人回复
- 融合PCR问题求助
已经有4人回复
- 询问融合PCR反应体系和条件
已经有2人回复
- 融合PCR引物设计
已经有1人回复
- PCR扩增融合基因
已经有21人回复
- 融合pcr引物设计
已经有14人回复
- 多重PCR引物的设计思路流程（融合基因）！！新手入门中。。各种问题。。
已经有0人回复
- 基因工程课程小结
已经有20人回复
- 怎么用PCR的方法构建一种兼具人超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的双功能融合蛋白？
已经有0人回复
- 【求助/交流】重叠PCR相关问题。
已经有8人回复
- 【求助/交流】菌液PCR的经验
已经有6人回复
2楼2017-01-19 14:59:14
梅太奇阿拉干
木虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 2137.8
- 红花: 5
- 帖子: 139
- 在线: 70.1小时
- 虫号: 2566697
- 注册: 2013-07-26
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:07
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:07
|
我不是高手，给你一点提示，你就按引物设计原则分别设计扩增geneA和geneB的引物，只不过是A的下游引物和B的上游引物加上linker序列不就行了吗，注意linker的退火温度和geneA的上游和geneB的下游相近就ok了，这样重叠退火时比较容易扩全长。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-01-19 21:23:01
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:39
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:39
|
设计四条引物，分别是 geneA和geneB的上下游引物，A的上游引物和B的下游引物正常设计即可，A的下有引物和B的上游引物需要包含linker序列（可以不全部包括在内，但是两条引物需要有重叠部分），然后先用引物扩增A和B，扩增出来后以扩增出来的A.B为模板，以A的上游引物和B的下游引物扩增A+linker+B序列。 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2017-01-20 04:11:46
|
已经做了一个多月了，还是链接不上，引物没有错误，让一个博士看了一下，引物没有设计错误，可就是融合不上，然后买了infusion 试剂盒，还是连接不上。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2017-01-21 09:43:36
9楼2017-01-21 13:38:21
10楼2017-01-23 11:43:29
sky蒲公英
版主 (文坛精英)
- 应助: 177 (高中生)
- 贵宾: 15.664
- 金币: 119295
- 散金: 13465
- 红花: 300
- 沙发: 1428
- 帖子: 19480
- 在线: 5618.4小时
- 虫号: 3384889
- 注册: 2014-08-27
- 性别: GG
- 专业: 免疫生物学
- 管辖: 文献求助
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:25
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-20 07:52:25
|
是两个片段的连接，分别设计单独基因的上下游引物，然后设计重叠引物，注意前段的连接顺序，设计a的下游重叠引物，b的上游重叠引物，经过pcr，最后用a的上游与b的下游作为引物，以各个基因的linker作为模板，可进行融合。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-01-20 01:39:29
6楼2017-01-21 09:41:40
8楼2017-01-21 10:09:42
5