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Northern blot实验 已有2人参与
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实验方法原理 Northern blot的基本概述是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。 实验材料 DNA 试剂、试剂盒 MOPS电泳buffer、甲醛凝胶加样buffer、EB、EGFR探针、DIG、SSC 仪器、耗材 水平电泳仪、制冰机、恒温水浴箱、凝胶成像系统、EP管、移液器、Tip头 实验步骤 一、RNA转移与固定 1. 变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30 min。 2. 按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。 4. RNA染色，干燥的尼龙膜先于5%冰乙酸中室温浸泡15 min。 5. 于0.5 mol/L 乙酸钠和0.04%亚甲蓝溶液中浸泡5~10 min。 6. 去离子水淋洗膜5~10 min，可见RNA标准及28s及18 sRNA的条带，软铅笔标记。 二、预杂交、杂交及显色 1. Washing buffer润洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。 3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。 4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。 5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。 6. 将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不要摇动）。 7. 当出现条带时，TE-buffer洗膜（5 min×1），终止现色。 8. 照相记录，80℃烤干，储存。 9. 扫描计算EGFR基因扩增的倍数。 注意事项 1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。 2. 凝胶中最好不要加入EB，以免降低杂交的效率。 3. 为降低膜杂交本底，可适当延长预杂交时间。 |
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