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zhangdie

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr产物一开始条带比较亮，后来再做就暗了，刚刚还出现了新产物？ 已有2人参与

marker2000，目的基因1100bp，引物是师姐帮忙设计的，CG含量比较低Tm50也比较低所以特异性不高，但是跑出来了如图一，送检后说有套峰师姐让我做连接转化看看，但是后来再跑同样的pcr那个条带就暗了如图二，刚刚又跑了个40-50°c梯度的pcr(图三)，结果还出了新的产物。
图三标记出的和我第一次跑的退火温度基本上一致48.2度，第一条条带没有最开始亮但位置大致是一样的，但500左右很亮。刚刚接触分子生物实验..还请指教

pcr产物一开始条带比较亮，后来再做就暗了，刚刚还出现了新产物？


pcr产物一开始条带比较亮，后来再做就暗了，刚刚还出现了新产物？-1


pcr产物一开始条带比较亮，后来再做就暗了，刚刚还出现了新产物？-2


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1楼 2016-12-20 20:00:10
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guishuai_tj

铁虫 (著名写手)
我想求教楼主，第一个图的marker貌似没跑好，你是怎么调整的图二图三的marker就跑的很好，我最近跑pcr老是marker跑不好，跟你的图一很像

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哈哈
2楼2016-12-20 20:42:08
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zhangdie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guishuai_tj at 2016-12-20 20:42:08
我想求教楼主，第一个图的marker貌似没跑好，你是怎么调整的图二图三的marker就跑的很好，我最近跑pcr老是marker跑不好，跟你的图一很像

我的是核酸染料过期了。。要不就试试换新的缓冲液

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3楼2016-12-20 22:38:00
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guishuai_tj

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangdie at 2016-12-20 22:38:00
我的是核酸染料过期了。。要不就试试换新的缓冲液
...

哦，我的核酸染料也过期了，只过期了一个多月，我也怀疑是这个原因，但还没买新的凑活用着

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4楼2016-12-20 22:40:41
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zhangdie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by guishuai_tj at 2016-12-20 22:40:41
哦，我的核酸染料也过期了，只过期了一个多月，我也怀疑是这个原因，但还没买新的凑活用着
...

我之前是明显感觉胶染完的颜色比以前浅了，换了别组的染料就好了

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5楼2016-12-20 22:52:09
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往生花

至尊木虫 (文坛精英)
建议连T载体，再送质粒测序

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生而必争朝夕，活而必尽善美
6楼2016-12-20 23:15:23
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-21 07:38:36
有二聚体，建议退火温度可以稍高一些，可以减少非特异行，另外延伸时间可以增加些，模板量可以适当加大。

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
7楼2016-12-20 23:25:25
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生物狗-哈

新虫 (初入文坛)
退火温度可能太低了，我觉得可以引物重新设计下，可以试试Phanta高保真酶
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8楼2016-12-28 15:13:55
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浮笙若梦

铁虫 (初入文坛)
好好研究这个新产物，说不定被你研究出什么来了，下个诺贝尔奖获得者就是你
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9楼2016-12-28 15:31:28
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

退火温度太低，非特异性扩增产物增加。一般默认55度都能扩增的很好，不要死守TM值
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10楼2016-12-28 20:41:10
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