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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 绝对定量标准品质粒稀释问题求助！
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)

[交流] 绝对定量标准品质粒稀释问题求助！ 已有6人参与

初次接触绝对定量PCR，要用质粒做标准品，做标准曲线。经计算后我的提取的质粒拷贝数为79205720169/ul，老师让我把质粒稀释成10的8次方个拷贝/ul到10个拷贝/ul，8个梯度，而且要很精确很，一个都不能差。我想了一下，感觉实在做不到那么精确，请问这样该如何稀释？谢谢各位大神！
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1楼 2016-12-08 16:29:00
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peitaokong

银虫 (小有名气)
★
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绝对定量，标准品确实需要精确稀释，因为标准品是用来构建标准曲线，用来计算拷贝数的，肯定要准。首先你要换算成科学计算法，你这个是79.2*1E9(10的九次方的意思）,然后稀释79.2倍，取5微升质粒，加391微升TE buffer(如果用水的话稳定性很差），这就变成了1*1E9（10的九次方）。然后你取5微升质粒，加入45微升的TE buffer，稀释成1*1E8（10的八次方）。照此稀释。
稀释标准品过程，一定要记着加完后，让溶液静置五分钟，分子充分运动混合均一，一定要带手套，找一个相对安静没有认来回走动的地方，来做这个事情，每稀释一个浓度注意换一次手套。希望能够帮助你。
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11楼2016-12-14 20:10:42
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许彦

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by ljf0814 at 2016-12-08 17:18:36
我之前这样做了一次，但老师说不行，必须严格稀释，也就是说最小的梯度中每微升只能有10个质粒，最大的梯度中每微升只能有10的8次方个质粒。我就不知道该怎么稀释比较好了。...

你老师不是搞分子生物的吧，

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4楼2016-12-08 22:14:51
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许彦

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-09 07:31:18
差不多就行。个人建议10ul+90ul这样稀释，震荡，离心。

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2楼2016-12-08 17:12:18
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by mochenmi at 2016-12-11 23:47:59
楼主问一下，质粒拷贝数是怎么算的？能直接测嘛？我只知道测质粒的浓度，单位是ng\ul

还要算出质粒的分子质量，也就知道质粒的摩尔质量M，用OD/M，再乘以阿伏伽德罗常数就行了，注意单位统一。
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10楼2016-12-12 10:26:30
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peitaokong

银虫 (小有名气)
★
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14楼: Originally posted by ljf0814 at 2016-12-14 22:42:53
十分感谢你，写得太详细了！我还想问一下，让溶液静置五分钟后还需不需要用枪或者震荡混匀？静置需要在冰上吗？...

体系加好后，需要振荡混匀，最好不要用枪混匀，然后短暂离心一下，再静置五分钟
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15楼2016-12-15 08:03:46
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 许彦 at 2016-12-08 17:12:18
差不多就行。个人建议10ul+90ul这样稀释，震荡，离心。

我之前这样做了一次，但老师说不行，必须严格稀释，也就是说最小的梯度中每微升只能有10个质粒，最大的梯度中每微升只能有10的8次方个质粒。我就不知道该怎么稀释比较好了。
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3楼2016-12-08 17:18:36
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 许彦 at 2016-12-08 22:14:51
你老师不是搞分子生物的吧，
...

专门做分子的，他说他做实验就是这么做的。。。
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5楼2016-12-08 22:41:07
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljf0814 at 2016-12-08 22:41:07
专门做分子的，他说他做实验就是这么做的。。。...

祝好

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6楼2016-12-09 05:41:42
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xiaoxie2020

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没必要啊，90+10，3个9

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7楼2016-12-09 07:54:41
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiaoxie2020 at 2016-12-09 07:54:41
没必要啊，90+10，3个9

我也觉得没必要，可是老师就让这么做。。。
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8楼2016-12-09 12:11:10
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mochenmi

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主问一下，质粒拷贝数是怎么算的？能直接测嘛？我只知道测质粒的浓度，单位是ng\ul

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9楼2016-12-11 23:47:59
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