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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求帮忙分析下我的梯度PCR电泳图
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小鱼于abc

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[求助] 求帮忙分析下我的梯度PCR电泳图 已有1人参与

如图，我做了梯度pcr，每块胶上两个基因，都是从左到右温度升高，每个基因8个孔4个温度（一个温度两个重复）。第一块胶两端有marker，下边那块胶左端有marker。一起跑的pcr一起跑的电泳，为什么有的基因条带比较漂亮有的就那么厚呢，高度不一样啊，我第一次做梯度，不太懂。
我用的是ABI的pcr仪，电泳是1μl LoadingBuffer+4μl cDNA，100V   25min。求指教啊。
而且我看，一个基因四个温度变化，电泳图变化不是很明显的样子啊，怎么回事呢？

求帮忙分析下我的梯度PCR电泳图


@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-12-06 21:57:31
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sky蒲公英

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四个温度相差多少？

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
2楼2016-12-06 22:06:37
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sky蒲公英

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感谢参与，应助指数 +1
温度相差不大的话，结果就不会有太大的区别

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
3楼2016-12-06 22:07:14
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小鱼于abc

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3楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-06 22:07:14
温度相差不大的话，结果就不会有太大的区别

四个温度都是一度一度升的，这样看来就是相差不大咯

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4楼2016-12-06 22:53:09
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sky蒲公英

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4楼: Originally posted by 小鱼于abc at 2016-12-06 22:53:09
四个温度都是一度一度升的，这样看来就是相差不大咯
...

可以多设几个温度进行。

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小鱼于abc
知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
5楼2016-12-06 23:07:08
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小鱼于abc

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5楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-06 23:07:08
可以多设几个温度进行。
...

谢谢你这么晚还给回复。我是根据引物合成说明书上的上下游Tm设的，大于最大、小于最小的这个范围，，，我这样设，合理么

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6楼2016-12-06 23:18:08
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sky蒲公英

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6楼: Originally posted by 小鱼于abc at 2016-12-06 23:18:08
谢谢你这么晚还给回复。我是根据引物合成说明书上的上下游Tm设的，大于最大、小于最小的这个范围，，，我这样设，合理么
...

可以求其平均值，在此上下选择。我们都是50-70度进行，每两度一个梯度。

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小鱼于abc
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7楼2016-12-06 23:40:44
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小鱼于abc

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7楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-06 23:40:44
可以求其平均值，在此上下选择。我们都是50-70度进行，每两度一个梯度。
...

哇哦，懂得了，谢谢哦

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8楼2016-12-07 07:08:05
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小鱼于abc

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7楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-06 23:40:44
可以求其平均值，在此上下选择。我们都是50-70度进行，每两度一个梯度。
...

我又遇到问题了，那像第一个和第四个基因这样的条带，条带模糊、宽，是不是引物不够好呢，

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9楼2016-12-07 10:58:33
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sky蒲公英

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9楼: Originally posted by 小鱼于abc at 2016-12-07 10:58:33
我又遇到问题了，那像第一个和第四个基因这样的条带，条带模糊、宽，是不是引物不够好呢，
...

引物设计不好，非特异性就会多。用的模板一样的话就有可能是引物的问题了。

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10楼2016-12-07 11:09:38
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