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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何使pcr产物是环状的，求指导
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痞子无敌

金虫 (正式写手)

[求助] 如何使pcr产物是环状的，求指导 已有2人参与

如题。模板是环状质粒，如何设计引物使pcr产物为环状，使其可以直接转化大肠。另外，如可以，请指教，线性质粒转化，长出来的都是假阳性，对吗？

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当你当你的眼睛眯着笑
1楼 2016-11-29 12:57:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

寰宇清

新虫 (小有名气)
设计5'端反向互补的两条引物，朝外扩。产物用DNPI酶处理，切碎野生型有甲基化的模板，转化大肠杆菌，涂板鉴定，阳性率一般来说极高。

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11楼2016-11-30 20:39:47
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寰宇清

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 痞子无敌 at 2016-11-30 21:08:30
那我是设计完全互补的两条引物1和1’呢，还是设计部分互补的2和2’呢？

...

喔，看见了。完全互补的引物自己结合了。引物2的互补部分还是太多。有6个碱基互补就够了。

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痞子无敌
14楼2016-12-01 07:08:54
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普通回帖

不吃M的鱼

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-30 11:03:35
xn8008: 应助指数+1 2016-11-30 11:03:40
模板是环状的，为啥还要pcr后转化？不直接转化？PCR应该P不出环状的

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2楼2016-11-29 13:58:46
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-30 11:03:47
1.用高保真酶P,P完后用平滑末端链接条件连接。
2.线性质粒转化，长出来的都是假阳性，对吗？（错，线性质粒转化不长菌，就算长出来了，那也只能是质粒，假阳性是要连接目的片段后才能这样说。)
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2016-11-29 16:48:13
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2016-11-29 13:58:46
模板是环状的，为啥还要pcr后转化？不直接转化？PCR应该P不出环状的

如点突变，就可以这样，省时省力

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当你当你的眼睛眯着笑
4楼2016-11-29 20:48:14
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2016-11-29 16:48:13
1.用高保真酶P,P完后用平滑末端链接条件连接。
2.线性质粒转化，长出来的都是假阳性，对吗？（错，线性质粒转化不长菌，就算长出来了，那也只能是质粒，假阳性是要连接目的片段后才能这样说。)

看到了文章里这样用。如果产物是环状的，就不用环化了，省去一个步骤。

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当你当你的眼睛眯着笑
5楼2016-11-29 20:50:07
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 痞子无敌 at 2016-11-29 20:48:14
如点突变，就可以这样，省时省力
...

那是用一对完全互补配对的引物P?扩增出来是环化的产物。没试过，下次如果有遇到到时可以尝试尝试。

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6楼2016-11-30 08:05:54
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mailmrcai

铜虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-11-30 21:56:13
不能是环状的，只能两末端能互补配对，只要让引物部分互补配对就行了，产物可以用来转化，你百度LIC原理看看就知道

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Comeon！
7楼2016-11-30 08:50:13
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mailmrcai at 2016-11-30 08:50:13
不能是环状的，只能两末端能互补配对，只要让引物部分互补配对就行了，产物可以用来转化，你百度LIC原理看看就知道

百度而来的原理似乎不一样…

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当你当你的眼睛眯着笑
8楼2016-11-30 19:04:32
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mailmrcai

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by 痞子无敌 at 2016-11-30 19:04:32
百度而来的原理似乎不一样…
...

其实本质是一样的

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Comeon！
9楼2016-11-30 20:09:31
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寰宇清

新虫 (小有名气)
设计5'

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10楼2016-11-30 20:36:20
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