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痞子无敌

金虫 (正式写手)

[求助] 如何使pcr产物是环状的,求指导 已有2人参与

如题。模板是环状质粒,如何设计引物使pcr产物为环状,使其可以直接转化大肠。另外,如可以,请指教,线性质粒转化,长出来的都是假阳性,对吗?

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当你当你的眼睛眯着笑
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寰宇清

新虫 (小有名气)

设计5'端反向互补的两条引物,朝外扩。产物用DNPI酶处理,切碎野生型有甲基化的模板,转化大肠杆菌,涂板鉴定,阳性率一般来说极高。

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11楼2016-11-30 20:39:47
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不吃M的鱼

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-30 11:03:35
xn8008: 应助指数+1 2016-11-30 11:03:40
模板是环状的,为啥还要pcr后转化?不直接转化?PCR应该P不出环状的

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2楼2016-11-29 13:58:46
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-30 11:03:47
1.用高保真酶P,P完后用平滑末端链接条件连接。
2.线性质粒转化,长出来的都是假阳性,对吗?(错,线性质粒转化不长菌,就算长出来了,那也只能是质粒,假阳性是要连接目的片段后才能这样说。)
采菊东篱下,悠然见南山。
3楼2016-11-29 16:48:13
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痞子无敌

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 不吃M的鱼 at 2016-11-29 13:58:46
模板是环状的,为啥还要pcr后转化?不直接转化?PCR应该P不出环状的

如点突变,就可以这样,省时省力

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当你当你的眼睛眯着笑
4楼2016-11-29 20:48:14
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